论文部分内容阅读
输血是近代医学巨大成就之一,挽救了大量因严重失血或贫血而生命垂危的病人。安全输血的前提是配合性输血,只有交叉配血的结果完全相符,即供患者血型相容才能进行输血。自1901年K.Landsteiner发现了人类的ABO血型系统以来,人类血型经过100多年的研究,共有270个公认的血型抗原被发现,相关研究已经非常深入完善,但是对动物血型和输血方面的研究则相对较少。研究动物的血型,首先需对其血液相关成分、生化指标及基因进行分析。本研究选择了亚洲黑熊作为研究对象是因为亚洲黑熊是国宝大熊猫的近亲,对亚洲黑熊血型研究的成果和经验可为大熊猫血型的研究提供非常有用的信息。本文主要从以下儿个方面对亚洲黑熊血样进行了研究：1.亚洲黑熊血浆中同种免疫性血型抗体(IgM, IgG)的检测分析通过红细胞血凝试验检测亚洲黑熊血浆中的IgM血型抗体。结果显示,在所检测的33只黑熊血样中发现,有2只黑熊的血浆中,存在比较明显的IgM类血型同种抗体,该抗体与75%的黑熊红细胞发生特异性抗原抗体反应,并导致红细胞凝集。通过Polybrene方法进一步对亚洲黑熊血浆中的IgG型血型抗体进行检测,可能是由于血浆中抗体的浓度较低,加上现有的检测方法都是针对人的红细胞血型抗体,而亚洲黑熊的红细胞同人的红细胞在膜电位和凝集的最佳溶液离子强度等方面存在差异,在两次采集的黑熊血浆中,本研究都均未发现存在明显的IgG类血型同种抗体。2.抗黑熊IgG抗体的制备及黑熊血型IgG同种抗体间接抗球蛋白试验分析提取亚洲黑熊血浆中的免疫球蛋白IgG,并制备兔抗熊IgG抗体。利用饱和硫酸铵法对亚洲黑熊血浆中的免疫球蛋白进行分离提取,得到免疫球蛋白的粗提物透析3次进行浓缩,得到较高纯度的免疫球蛋白。将浓缩后的样本免疫新西兰大白兔,经过4次免疫后,ELISA检测抗血浆效价>1：512,最终用protein A纯化抗血浆得到兔抗熊IgG抗体。利用该兔抗熊IgG抗体,对第二次采集的33只黑熊血样的红细胞和血浆分别经两两交叉混合后,检测其血浆中上是否存在IgG血型同种抗体。结果,未发现明显的IgG类血型同种抗体。3.亚洲黑熊红细胞膜电位测定与比较膜电位对维持红细胞各种生理活动正常进行起着重要的作用,研究亚洲黑熊红细胞静息膜电位对于其红细胞的保存及相关反应条件的确立有重要意义。本研究采用膜电位荧光染料双(1,3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔(DiBAC4(3))进行膜电位的测定。用DiBAC4(3)测定得到人红细胞静息膜电位为-10.67±0.54mv与膜片钳测得的数值相吻合,说明荧光染料DiBAC4(3)测定的膜电位比较可信。用这种方法测得亚洲黑熊红细胞的静息膜电位为-12.35mv。4.亚洲黑熊MHC Ⅱ类分子DRB、DQA基因多态性分析提取亚洲黑熊血液基因组DNA,选取主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子中多态性最高的DRB和DQA位点的第二外显子序列作为分析区域,采用PCR扩增和克隆测序等方法对40只亚洲黑熊的DQA和DRB位点的第二外显子序列进行了多态性分析。在40只亚洲黑熊样本中检测出了9种DQA第二外显子等位基因和13种DRB第二外显子等位基因,相对于大熊猫,亚洲黑熊的DQA和DRB具有很高的多态性。通过对氨基酸序列抗原结合位点的同义替换和非同义替换的比较,证明了DQA和DRB位点的平衡选择作用。