随着人类能源需求的不断增加、化石能源的日益枯竭和环境污染的日渐加重,寻找和开发新的、清洁的、可再生能源(太阳能、风能和生物质能等)成为研究人员亟需解决的问题。目前生物乙醇主要由酿酒酵母或运动发酵单胞菌利用简单生物质生产,虽然这两种菌可高产乙醇,但其底物利用谱窄,只能利用由糖/淀粉类(甜菜、玉米和高粱等)生物质水解而生成的可发酵糖。嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoense)具有在高温下促进底物的高效转化、较宽的底物利用范围、较高的分解代谢活性、较短的发酵时间和易于乙醇回收等特点,是能利用复杂木质纤维素生产生物乙醇的优势菌种,但其乙醇耐受性较弱,且副产物较多。因此,研究提高嗜热厌氧杆菌的乙醇耐受性和乙醇的生产能力具有重要意义。基于不同浓度乙醇刺激的T.aotearoense SCUT27的转录组数据,选取在高乙醇刺激下显著低表达的丙酮酸甲酸裂解激活蛋白基因(pflA)(甲酸合成途径中的关键酶)为研究对象,pflA基因的敲除会导致甲酸合成途径被阻断,导致更多的碳代谢流流向乙醇,从而提高乙醇的产量。课题组前期成功敲除丙酮酸甲酸裂解激活蛋白(pflA)基因,获得了工程菌T.aotearoense SCUT27/△ldh/△pflA,本文中通过Southern blot实验结果予以证实。在T.aotearoense改良液体培养基(MTC_m)中进行发酵时,SCUT27/△ldh/△pflA生长受到抑制,尽管乙酸产量大幅下降,但乙醇产量并无显著提高。以富营养培养基(MTC_n)进行摇瓶发酵时,工程菌的乙醇产量和转化率分别提高12.36%和20.02%,乙酸产量下降28.81%;工程菌的乙醇耐受性高于出发菌,其能在高乙醇浓度的条件下保持较高活力。SCUT27/△ldh/△pflA在发酵罐中进行游离细胞补料发酵,其乙醇产量和生产速率分别达到了38.82 g/L和0.35 g/L·h,比原始菌提高了49.02%和9.38%。同时乙酸产量为6.12 g/L,比原始菌降低了36.77%。为进一步提高工程菌的乙醇生产能力,采用纤维床固定化细胞补料发酵模式。结果显示工程菌的乙醇产量达到45.01 g/L,比原始菌提高26.39%,同时乙醇的生产速率达到0.45 g/L·h,与原始菌相比提高32.35%。同时为降低乙醇对发酵菌株的毒性,采用气提法原位移除乙醇。优化后的气提最佳条件为:发酵液乙醇浓度25 g/L、发酵液温度55℃、气体流速1.7 L/min、冷凝温度0℃。为实现工程菌连续发酵生产高浓度乙醇,采用气提耦合固定化补料发酵方式。结果表明,气提冷凝后乙醇浓度能达到120 g/L,能显著降低乙醇后续蒸馏回收的成本。本研究将基因工程与过程工程结合,不仅提高嗜热厌氧菌的乙醇生产能力,同时降低了乙醇对细胞的毒性,实现了多批次的补料发酵。此外,还对工程菌的木质纤维素水解液利用能力进行了初步研究。首先,通过响应面分析确定花生壳预处理的最佳条件为:处理温度121℃、稀硫酸浓度0.03 mol/L、预处理时间48 min、液料比10.18,此预处理条件下酶解过后总糖浓度为22.57 g/L;而对对玉米芯的水解则采用文献中已优化的方法(总糖浓度为28.95 g/L)。然后以总糖约为25 g/L的玉米芯水解液(CCH)和花生壳水解液(PSH)为底物分别发酵生产乙醇,工程菌的乙醇产量分别为4.84 g/L和5.82 g/L,与原始菌株相比分别提高了9.19%和9.25%。综上所述,敲除pflA可以显著提高嗜热厌氧杆菌的乙醇产量,同时降低副产物乙酸的生成。在随后的实验中,利用气提耦合固定化补料发酵进一步提高了工程菌的乙醇生产效率,为微生物发酵法产乙醇的发展提供了新思路。