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研究背景和研究目的肝细胞性肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是世界范围恶性肿瘤的第二大死亡原因。2017年中国最新癌症数据显示,肝癌的发病率在我国男性患者中居第三位,死亡率居我国恶性肿瘤第二位,已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。目前,传统的手术切除被公认是治疗HCC的最有效措施,另外非手术治疗如肝动脉化疗栓塞、局部射频消融、放射治疗和新兴的分子靶向药物治疗等也取得了一定疗效,但是这些治疗方式并没有显著提高HCC患者的生存期。因此探讨肝细胞性肝癌的发生发展及浸润、转移的分子机制,对肝细胞性肝癌的分子诊断、预防和治疗有重要意义。血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是由恶性肿瘤细胞通过自身变形模仿内皮细胞并与细胞外基质相互作用组成的模拟血管壁结构的模式,以达到重塑肿瘤微循环的目的。VM是肿瘤生长早期的主要血供来源。迄今为止,对VM的研究主要集中在VM的形态结构、VM形成的机制和涉及的信号通路等,在VM的各种调控机制中并没有找到一个高特异性的抗VM形成的治疗靶点。癌相关成纤维细胞（Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最重要的宿主细胞之一,有研究发现CAFs可促进肿瘤血管生成、促进肿瘤免疫抑制、激活信号通路和促使肿瘤细胞发生上皮-间质转化等,从而增加肿瘤细胞的恶性表型。但是目前在肝细胞性肝癌中CAFs对VM的研究还鲜有报道。为了研究肝细胞性肝癌中CAFs对VM的影响,本课题首先探讨肝细胞性肝癌组织中CAFs与VM的相关性,然后利用酶消化法分离纯化肝细胞性肝癌组织中的CAFs,收集上清液作为条件培养基,观察CAFs条件培养基对肝癌细胞体外VM的影响。研究方法1、肝细胞性肝癌组织中Vimentin和α-SMA的表达与VM的相关性研究（1）收集60例肝细胞性肝癌组织和10例正常肝组织;（2）利用CD31/PAS双染色分别检测60例肝细胞性肝癌组织和10例正常肝组织中VM的表达情况,并分析VM与各临床病理特征的相关性;（3）用免疫组织化学染色观察Vimentin和α-SMA的表达情况,并分析它们与VM的关系。2、肝细胞性肝癌相关成纤维细胞对肝癌细胞体外血管生成拟态的影响（1）采用酶消化法获得原代细胞,通过差速酶消化法联合反复贴壁法进行CAFs的纯化;（2）通过细胞形态观察和免疫细胞化学染色进行CAFs的鉴定并收集条件培养基;（3）用三维培养技术培养不同转移潜能的人肝癌细胞株（高转移性肝癌细胞MHCC-97H、低转移性肝癌细胞SMMC-7721）和人正常肝细胞株L02,筛选出VM表达最高的细胞株;（4）设置不含CAFs条件培养基的对照组和含不同浓度CAFs条件培养基（25%、50%、75%）的实验组,利用三维培养技术检测各组条件培养基对MHCC-97H细胞VM的形成情况;（5）采用Real-Time PCR和Western blot检测各组MHCC-97H细胞基质金属蛋白酶-2（MMP2）和上皮细胞激酶-2（Eph A2）的m RNA和蛋白的表达水平。研究结果1、肝细胞性肝癌组织中Vimentin和α-SMA的表达与VM的相关性研究（1）肝细胞性肝癌组织中VM的阳性表达率为35.0%,正常肝组织中无VM表达;（2）VM的表达与肿瘤的大小、Edmondson分级、临床分期以及是否伴有肝硬化有关（x~2=5.862,6.782,5.910,5.444;P0.05）;（3）VM阳性组的Vimentin和α-SMA表达均高于VM阴性组（x~2=6.093,5.038;P<0.05）。2、肝细胞性肝癌相关成纤维细胞对肝癌细胞体外血管生成拟态的影响（1）成功分离出纯度较高的CAFs;细胞呈长梭形或星芒状,核圆形或卵圆形;免疫细胞化学染色示,细胞表达波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白;（2）MHCC-97H细胞在三维培养条件下形成VM,SMMC-7721和L02不形成VM;（3）对照组、条件培养基低浓度组、条件培养基中浓度组和条件培养基高浓度组的MHCC-97H细胞形成VM数分别是14.67±1.528,24.33±2.517,25.33±4.041,27.00±3.000,各实验组与对照组比较,差异有统计学意义（F=10.899,P0.05）。（4）各组MHCC-97H细胞中MMP2和Eph A2的m RNA相对表达量为1±0.0000,3.250±0.672,3.950±0.432,3.484±0.530和1±0.0000,3.619±0.838,2.922±0.281,2.961±0.188,各浓度组与对照组相比差异有统计学意义（F=22.524,18.784;P0.05）。结论1、肝细胞性肝癌组织中Vimentin和α-SMA的表达与VM形成存在相关性;2、通过酶消化法成功培养、分离纯化出原代肝细胞性肝癌CAFs;3、肝细胞性肝癌CAFs条件培养基可以促进高侵袭性肝癌细胞株MHCC-97H的VM形成。