丁酸梭菌细胞外囊泡的制备、表征及其缓解小鼠结肠炎的作用研究

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目的:细胞外囊泡(Extracellularvehicle,EVs)能够选择性富集特定蛋白,并且有效规避了活体菌储存周期短、对免疫缺陷人群造成感染等缺点,在疾病治疗中展现出巨大潜力。此外,EVs也是很好的药物载体。目前,已有报道益生菌EVs在治疗疾病方面的有效性,而有关机理方面的研究却十分匮乏。本文章探索丁酸梭菌EVs的制备与表征及其对小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用。方法:(1)丁酸梭菌EVs的分离制备。厌氧培养丁酸梭菌,超速离心法分离获得丁酸梭菌EVs,透射电镜分析形貌、NTA分析粒径、SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白质分布;(2)探究丁酸梭菌EVs对溃疡性结肠炎小鼠的缓解作用。建立恶唑酮(Oxazalone,OXA)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型后,给药丁酸梭菌(28 mg/(kg·day))及其EVs(1011 particles/day)。观察小鼠体重变化与结肠形态变化,计算疾病活动指数(DAI),ELISA法检测血清中炎症因子含量,检测血清中SOD活性与MDA水平,HE染色、PAS染色及免疫组化法分析结肠物理屏障的变化,免疫荧光(IF)技术观察结肠组织固有层中CD11c、LC3b的变化,流式细胞术(FCM)分析脾脏内初始T细胞的分化情况;(3)丁酸梭菌EVs缓解肠道炎症的分子机制初探。分离的小鼠树突状细胞(Dendriticcells,DCs),经确定浓度(50μg/mL)的EVs处理后,流式细胞术分析DCs中抗原呈递相关分子MHCⅡ及共刺激分子CD80、CD86的表达情况。此外,建立DCs与初始T细胞的共培养体系,流式细胞术分析受激活的DCs对初始T细胞分化的影响。结果:(1)利用超速离心法成功制备了丁酸梭菌EVs。丁酸梭菌EVs呈现典型的双膜囊泡结构,其粒径分布在100-300 nm之间,其蛋白质大小集中在135 kDa附件,少部分集中在100-135 kDa和48-63 kDa,总蛋白含量可达562 mg/mL;(2)丁酸梭菌EVs能够改善OXA诱导的溃疡性结肠炎。研究发现,EVs灌胃后,溃疡性结肠炎小鼠的体重下降减轻、结肠肿胀程度减弱、疾病活动指数降低,血清炎症相关因子(IL-4、IFN-γ)的表达量下降,SOD活性升高以及MDA含量降低。从组化图中可以看出,EVs还能够保护结肠黏膜层完整性、防止隐窝被破坏,维持杯状细胞的数量和形态、改善免疫细胞的浸润程度等;(3)丁酸梭菌EVs会参与免疫反应。通过免疫荧光标记,发现EVs灌胃处理溃疡性结肠炎小鼠后,结肠组织固有层中DCs的数量减少,EVs对DCs的自噬影响不大。此外,OXA造模会刺激小鼠体内初始T细胞分化从而引发Th2介导肠炎,而EVs处理则能明显减少Th2的分化;(4)EVs会抑制DCs的抗原提呈能力。流式细胞术结果表明,EVs刺激DCs后,DCs中MHCⅡ、CD80、CD86的表达水平变化不大。然而EVs与LPS共同刺激DCs,EVs可以显著抑制LPS对DCs的刺激。进一步用EVs刺激的DCs与初始T细胞共培养,发现对初始T细胞的分化程度影响不大。然而EVs与LPS共同刺激的DCs与初始T细胞共培养,可以显著限制初始T细胞向Th2方向的分化。结论:(1)丁酸梭菌EVs具有典型的双膜结构,其粒径为100-300 nm;(2)丁酸梭菌EVs可以改善肠道黏膜屏障的完整性,降低炎症因子的水平,减轻CD4+T等淋巴细胞浸润程度,缓解OXA导致的肠道炎症;(3)丁酸梭菌EVs可以调节肠道固有层中DCs的数量及其抗原呈递能力,抑制其他抗原对树突状细胞的刺激,弱化树突状细胞的抗原呈递能力,限制初始T细胞向Th2分化的能力。
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