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出菇结实(fruiting-body forming)是食用菌繁殖后代的重要生命现象。食用菌的出菇受温度、湿度、光照和二氧化碳浓度等环境因素的深刻影响。一些食用菌必需受低温刺激才能使成熟菌丝从营养期转向繁殖期,这种独特转变称为“变温结实”。该特殊生物学现象,已经被广泛应用于食用菌的生产实践中,但是其分子机制尚不清楚。秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)又名袖珍菇、肺形侧耳、凤尾菇等,隶属真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。“农秀1号”是浙江省农科院通过杂交选育获得的秀珍菇高温型新品系,其具有典型短暂冷刺激诱导子实体形成的特点,是研究食用菌变温结实的理想材料。前期研究获得了秀珍菇变温结实相关的消减杂交文库,发现变温结实过程不仅涉及到下游代谢途径相关基因和细胞形态结构相关基因的表达水平变化,而且涉及到上游多个甚至全局性调控基因的表达变化。其中转录因子在这一重要的生命进程中扮演关键角色。因而转录因子的克隆和功能鉴定将会为食用菌变温结实分子机制的研究提供重要线索。本研究已从该文库中筛洗获得一个相关csl基因(属于CSL(CRF1/RRP-J κ/Suppressor of Hairless/LAG-1)转录因子家族)EST序列,结合前人报道,该基因可能参与秀珍菇发育、细胞分化及细胞粘附,是具有重要意义的转录因子基因。本研究将通过克隆分析该基因,希望能够为变温结实这一复杂过程的分子机制的阐明奠定基础。本研究通过TAIL PCR技术克隆了秀珍菇csl基因(Pleurotus pulmonarius csl-1,简写Ppcsl-1),Ppcsl-1基因由4个外显子和3个内含子组成。利用RACE技术获得该基因的cDNA全长。Ppcsl-1基因的CDS序列全长2991bp,编码一个996氨基酸组成的蛋白(命名为PpCSL-1)。PpCSL-1含有LAG1、BTD和IPT三个结构域,其DNA结合位点非常保守。PpCSL-1为亲水性蛋白,但包含一个明显的疏水结构,该疏水结构位于BTD结构域,说明该蛋白可能是跨膜蛋白或者可与膜结合的一类蛋白。选择30个真菌和后生动物的CSL,构建了CSL的系统发育进化树,并对这些CSL的结构域进行了比较分析,分析显示CSL在进化过程中结构域和DNA结合位点都比较保守。进化分析显示,在担子菌CSL中,PpCSL-1与糙皮侧耳Pleurotus ostreatus CSL (PoCSL)亲缘关系最近。通过荧光定量技术geNorm软件对ACT、GAPDH、eIF5、TUA、ATPase、RPL14等6个管家基因在秀珍菇不同生长发育时期的表达稳定性进行评价,结果表明,这些基因的表达稳定性平均值M分布在0.496至1.025之间,分别为RPL14 (0.496)>ATPase (0.536)>eIF5 (0.551)>ACT (0.702)>TUA (0.717)>GAPDH (1.025),其中RPL14的M值最低,说明其表达最稳定。以RPL14基因作参考基因,荧光定量检测Ppcsl-1基因在营养菌丝期、冷处理12h、原基期、珊瑚期和子实体期等不同发育时期的相对表达量,结果表明Ppcsl-1在菌丝经过5℃12h冷处理之后的表达量最高,表明其有可能被冷刺激诱导表达并在开启子实体形成的过程中起重要作用。