柑橘PG基因的鉴定及其与幼果脱落的相关性分析

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柑橘作为重要水果品种之一,具有经济价值高、营养丰富等特点,在我国种植范围较广。近年来,柑橘产业在部分地区已成为农民脱贫增收的支柱性产业,在乡村振兴中发挥着重要作用。虽然我国柑橘产业取得了显著发展,但异常的落花落果仍会严重影响柑橘产量,造成果农收入减少。因此,研究柑橘落花落果的分子机制,为制定柑橘保花保果技术措施提供参考依据至关重要。植物器官脱落的过程主要包括细胞分离和细胞程序性死亡。PGs(polygalacturonases)是一类果胶水解酶,能够引起细胞壁的修饰和水解,进而参与细胞分离,在植物器官脱落的过程中发挥着重要作用。然而,目前在柑橘中还未见关于PG基因家族的系统报道。本文基于克里曼丁和甜橙基因组,首次对柑橘PG成员进行了系统鉴定,分析了各成员的理化性质、基因结构、保守结构域、染色体定位、遗传进化关系、组织特异性以及在激素处理下的表达模式等。从‘塔罗科’血橙(Citrus sinensis L.cv.‘Tarocco’)中克隆获得了CitPG34基因及其启动子(CitPG34-P)序列,采用基因表达、遗传转化以及亚细胞定位等技术手段,初步分析了CitPG34在柑橘幼果脱落中的生物功能。主要结果如下:1.基于柑橘全基因组,利用拟南芥PGs为参考序列,首次鉴定出了38个柑橘PG基因家族成员,分别依次命名为CitPG1-38。理化性质分析表明成员之间较为相似,成员ORF框的长度位于378到2418 bp之间,预测蛋白质的p I值为4.83~9.92,分子质量为13951.71~85542.28 D。大多数成员含有3个及以上的内含子,表明CitPGs基因成员出现选择性剪接的可能性很高。结构域分析显示,大部分CitPGs成员都含有PG家族典型的4个保守结构域SPNTDG、GDDC、CGPGHG、RIK。系统进化树分析表明,柑橘PG成员与其它植物PG成员聚类在一起,分别位于3个不同的分支中,表明该基因家族在植物进化过程中较为保守,但成员之间功能却存在差异。在38个柑橘PG成员中,有9个成员即CitPG2,CitPG3,CitPG10,CitPG24,CitPG27,CitPG29,CitPG30,CitPG33和CitPG34与脱落相关的PGs亲缘关系较近。利用RT-qPCR进一步分析表明,CitPG2,CitPG29和CitPG34受ACC诱导,却受IAA的抑制与柑橘幼果脱落明显相关。2.根据前期实验结果,从‘塔罗科’血橙幼果离层A中克隆获得了CitPG34(Orange1.1g027251m),生物信息学分析结果显示,该基因ORF长度为1194 bp,含有2个内含子,可编码397个氨基酸,预测蛋白分子量为41472.60 D,理论等电点为5.19,其不稳定系数为30.23,表明CitPG34属于稳定蛋白。通过在线软件TMHMM分析发现:CitPG34为跨膜蛋白,具有一个跨膜结构,位于第7-29位氨基酸之间。在Cit PG34二级结构中,α-螺旋结构约占15.37%,扩展链约占29.72%,无规则卷曲约占54.91%,与其三级结构预测基本一致。该基因具有PG家族典型的4个保守结构域SPNTDG、GDDC、CGPGHG、RIK。NJ树分析显示,CitPG34与西洋梨PcPG3(BAF42034)亲缘关系最近,且与番茄脱落相关的基因TAPG1、TAPG2和TAPG4同属于A分支,表明该基因可能参与了柑橘幼果脱落。组织特异性表达分析结果显示,Cit PG34在花中表达量最高,在根、叶、离层A、离层C中表达量较低,在果中几乎不表达。亚细胞定位发现,Cit PG34主要位于细胞壁。将Cit PG34构建过表达载体,转化烟草,获得T0代转基因烟草,为后续研究提供了试材。3.克隆获取CitPG34起始密码子(ATG)前2075 bp启动子序列(CitPG34-P),PlantCare预测发现,在CitPG34-P序列上存在多种顺式调控元件,如光、干旱胁迫、厌氧胁迫、真菌诱导和激素(脱落酸、茉莉酸、赤霉素)响应的顺式作用元件。构建CitPG34-P::gus表达载体,转化烟草,通过GUS化学组织染色显示,该启动子受乙烯诱导,主要在叶脉中表达。
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