论文部分内容阅读
背景:死亡时间(postmortem interval,PMI)或称死后经过时间(time since death,TSD)即发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔,PMI推断是法医学领域最为重要的研究课题之一。但由于影响PMI推断的因素很多,单一方法的准确性往往不能令人满意,多因素、多指标的综合研究,即人工神经网络(artificial neural network,ANN)的研究成为趋势。随着分子生物学和计算机技术的发展和应用,通过检测mRNA降解推断PMI成为可能。本研究应用一步法荧光标记逆转录-聚合酶联反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测了大鼠死后不同时间间隔脑、肝、脾、肾管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)及β-肌动蛋白(β-actin)mRNA的降解情况,旨在为PMI推断提供一种新的指标。目的:通过系统观察大鼠死后不同时间脑、肝、脾、肾管家基因GAPDH及β-actin mRNA的降解规律,确定大鼠死后不同组织GAPDH及β-actin mRNA的检测时限,探讨其在PMI推断上的法医学应用价值,为PMI推断的研究提供一种新的、可靠的检测指标。方法:Wistar大鼠56只,雌雄不限,体重200～250g,断颈处死后置于20℃温度控制系统内。分别于死后0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、72h、4d、5d、6d、7d、8d、9d解剖(n=4),按照RNA抽提的方法,分别提取大鼠脑、肝、脾、肾的总RNA,利用ABI 9700型PCR基因扩增仪,通过一步法复合荧光RT-PCR技术扩增,各时间点扩增产物分别在ABI 3100型DNA遗传分析仪上进行电泳分离,并应用其自带的分析软件(GeneScan Analysis Version 3.1),通过与Genescan-500TM ROX(marker)标准分子量作比对,确定脑、肝、脾、肾管家基因GAPDH及β-actin mRNA转化的PCR产物,记录并分析每个特异性峰的峰面积(Peak Area),各时间点与死后即时(0h)的峰面积之比值作为该点mRNA的相对含量。以未加RT/Platinum? Taq混合酶的作为实验阴性对照组。结果:大鼠死后7d脑组织、48h肝组织、32h脾组织、40h肾组织内均可检测到GAPDH mRNA,8d脑组织、72h肝组织、40h脾组织、48h肾组织内均可检测到β-actin mRNA,且其量均呈规律性下降趋势(电泳峰面积逐渐变小、谱带亮度逐渐变暗并最终消失),其扩增产物的降解过程呈现出一定的规律性。应用EXCEL 2003及SPSS 11.5对所测数据进行统计学处理及线性回归分析,发现大鼠死后不同时间脑、肝、脾、肾GAPDH及β-actin mRNA的相对含量均与PMI高度相关(P<0.01),并得出相应的回归方程:1.大鼠PMI(x,d)与脑mRNA含量(y)的回归方程: GAPDH:y=-0.122x+0.923,R2=0.973 (x≤7d)β-actin: y=-0.104x+0.925,R2=0.973 (x≤8d)2.大鼠PMI(x,h)与肝mRNA含量(y)的回归方程: GAPDH:y=-0.019x+0.989,R2=0.968 (x≤48h)β-actin: y=-0.013x+0.945,R2=0.890 (x≤72h)3.大鼠PMI(x,h)与脾mRNA含量(y)的回归方程: GAPDH:y=-0.025x+1.054,R2=0.969 (x≤32h)β-actin: y=-0.023x+1.021,R2=0.993 (x≤40h)4.大鼠PMI(x,h)与肾mRNA含量(y)的回归方程: GAPDH:y=-0.022x+1.049,R2=0.978 (x≤40h)β-actin: y=-0.018x+0.975,R2=0.991 (x≤48h)结论:本实验可得出以下结论:1.大鼠死后管家基因GAPDH、β-actin mRNA具有一定的稳定性。2.大鼠死后不同组织、不同管家基因mRNA的稳定性(即检测时限)不同:对于GAPDH,脑为7d,肝为48h,脾为32h,肾为40h;对于β-actin,脑为8d,肝为72h,脾为40h,肾为48h;与GAPDH mRNA相比,β-actin mRNA更不易降解。3.一步法荧光标记RT-PCR技术检测大鼠死后不同组织(脑、肝、脾、肾)管家基因GAPDH及β-actin mRNA的降解规律,可为PMI推断的研究提供一种新的、客观、有效的观测指标,可为常规PMI推断方法的补充。