在口腔、肠道、皮肤等人体的各个部位,共同生活着种类繁多、数量巨大的微生物群,这些微生物及其携带的遗传信息被认为是人体的第二基因组。作为微生物定殖的重要生态位点之一,口腔内已知存在着约1000种左右的微生物,它们和宿主之间的交互作用,与口腔及全身的健康及疾病状态密切相关,因此一直是人体微生物学研究的关注点之一。然而,约有一半的口腔微生物处于不可培养的状态,因此以传统的培养技术为基础的研究就受到了限制。同时,以个体微生物为研究对象的思路,亦无法从整体的角度为我们揭示口腔微生物群落与健康、疾病之间的联系。而不依赖培养技术的高通量测序技术的出现和发展解决了上述局限,为我们实现从整体角度进行微生物群落研究的目标提供了必要条件。人体微生物群落的组成和结构受到很多因素的影响,除了年龄、基因、共生位点等生理因素之外,还包括疾病、益生菌干预等因素。对于影响因素的研究,同样有利于加深我们对于人体微生物的认识和理解。本研究以学龄前乳牙列儿童的唾液为样本,采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对于龋病发生前后以及益生菌酸奶长期饮用前后的微生物群落进行系统性的对比研究,以期了解无龋学龄前乳牙列儿童口腔微生物群落的组成和结构特点,揭示龋病的发生与微生物群落特征改变之间的关联,探索益生菌酸奶干预对口腔微生物群落的影响,从而加深我们对于学龄前乳牙列儿童唾液微生物群落的认识,为口腔微生态的研究提供新的信息资源,并为学龄前乳牙列儿童龋病的微生物防治提供理论基础。目的:1、了解无龋学龄前乳牙列儿童唾液微生物群落的组成和结构;研究龋病发生前后,唾液微生物群落组成及结构的动态变化特征;2、以酸奶为载体,研究益生菌的长期作用对于学龄前乳牙列儿童唾液微生物群落的影响。方法:1、纳入35名无龋的学龄前乳牙列儿童作为受试者,采集他们的唾液样本。提取样本中微生物总的DNA后,采用通用引物扩增16S rRNA编码基因。使用Illumina MiSeq测序平台对扩增产物进行测序,所得序列读数与Silva数据库进行比对得到序列信息。采用生物信息学分析方法对唾液微生物群落进行从整体结构到分类学水平上组成特征的描述。2、纳入60名无龋的学龄前乳牙列儿童作为受试者,进行两年的追踪随访,每半年采集一次唾液样本,最终共有23名儿童完成了随访。所有样本使用Illumina MiSeq测序平台进行测序,获得序列信息。其中12名儿童最终罹患龋病,将受试者分为无龋组和龋病转化组,在不同时间点上进行组间横向比较,探讨龋病的发生发展对于唾液微生物群落多样性、结构及组成特征的影响。3、纳入20名无龋的学龄前乳牙列儿童作为受试者,每日给予益生菌酸奶100g,进行一年的追踪,每半年采集一次唾液样本,最终共有6名儿童完成了随访。所有样本使用Illumina MiSeq测序平台进行测序,获得序列信息。组内进行不同时间点上的纵向比较,探讨唾液微生物群落多样性、结构及组成在益生菌酸奶干预下的变化。结果:1、研究无龋的学龄前乳牙列儿童发现,男性儿童与女性儿童唾液微生物群落在组成多样性及结构方面没有统计学差异;通过微生物群落组成分析比较发现,奈瑟菌属(Neisseria)在男性儿童唾液中的含量显著高于女性儿童;对唾液微生物群落在门和属的水平上分别进行核心微生物组的定义,发现分别包括了 4个门和9个属的微生物,它们是放线菌门(Actinobacteria)及其下属的放线菌属(Actinomyces)和罗氏菌属(Rothia),拟杆菌门(Bacteroidetes)及其下属的二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas),厚壁菌门(Firmicutes)及其下属的链球菌属(Streptococcus)、孪生球菌属(Gemella)、颗粒链菌属(Granulicatella)和毛绒厌氧杆菌属(Lachnoanaerobaculum),以及变形菌门(Proteobacteria)及其下属的奈瑟菌属(Neisseria)。2、研究发现龋病发生后,龋病儿童唾液微生物群落的组成多样性与无龋儿童相比未发生显著变化,但是群落结构却发生显著变化;通过在物种的分类学水平上的比较分析发现,罗氏菌属(Rothia)、沙特尔沃思氏菌属(Shuttleworthia)的相对丰度在龋病的发生发展过程中显著下降,而奇异菌属(Atopobium)、巨球菌属(Megasphaera)以及韦荣菌属(Veillonella)的相对丰度在龋病的发生发展过程中显著上升;无龋儿童组和龋病转化组儿童的唾液核心微生物组的组成存在一定的差异。3、通过组内不同时间点上的纵向比较发现,益生菌酸奶的长期饮用伴随着唾液微生物群落结构的显著改变,1 1个属的微生物其相对丰度在组间存在着统计学差异,其中有7个属的微生物相对丰度在长期饮用益生菌酸奶后呈上升趋势,它们包括弯曲菌属(Campylobacter)、嗜血菌属(Haemophilus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、芽胞杆菌属(Bacillus)、卡托氏菌属(Catonella)、乳球菌属(Lactococcus)以及土壤芽胞杆菌属(Solibacillus),而有2个属的微生物相对丰度呈下降趋势,它们是孪生球菌属(Gemella)与链球菌属(Streptococcus)。结论:1、无龋学龄前乳牙列儿童的唾液微生物群落中存在着占优势地位的微生物种类,其中存在着核心微生物物种;性别因素不会造成唾液微生物群落物种多样性和群落结构的组间显著差异。2、龋病的发生不会导致唾液微生物群落中物种多样性的改变,但会导致群落结构的显著变化;罗氏菌属和沙特尔沃思氏菌属的相对丰度高低和龋病的发生呈负相关;反之,奇异菌属、巨球菌属和韦荣菌属的相对丰度高低和龋病的发生呈正相关。3、益生菌酸奶的长期饮用可引起无龋学龄前乳牙列儿童口腔中唾液微生物群落的结构变化,同时也会引起微生物物种相对丰度的显著改变,提示唾液微生物群落的组成和结构会受到长期益生菌酸奶干预的影响,而这些影响可能导致唾液微生态环境朝着有利于牙体及牙周健康方向变化。