生物被膜(biofilm,BF)是指附着在有生命体或非生命体表面的由细菌自身分泌的胞外多聚物包裹细菌所形成的膜样物。胞外多聚物由多糖、蛋白质及胞外DNA(eDNA)组成。简单的说,细菌生物被膜主要包括被包裹的细菌和细菌自身分泌的胞外基质。生物被膜的形成犹如给被包裹着的细菌添加了一层屏障,因此生物被膜的形成可以显著增强细菌耐受不利环境的能力。有研究报道,成熟生物被膜包裹的细菌对抗菌药物的敏感性为浮游状态的细菌的1/10-1/1000,耐热性也相应增加,对环境变化不敏感[1]。因此生物被膜的形成是细菌抵御外界不利环境的一种重要形式,也是造成临床感染难以治疗的重要因素之一。形成生物被膜的细菌主要有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。金黄色葡萄球菌,俗称金葡菌,呈圆形或卵圆形,革兰染色阳性,是一种重要的病原菌。金葡菌能引起皮肤软组织感染、肺炎、感染性心内膜炎、骨髓炎以及食物中毒等。随着抗生素的广泛使用,金葡菌的耐药性变得愈发严峻[2,3],例如耐甲氧西林的金葡菌MRSA,中介耐万古霉素的金葡菌VISA,耐万古霉素的金葡菌VRSA等的出现和流行,给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。世界卫生组织(WHO)已将MRSA/VISA列为高度优先迫切需要开发抗菌药物的12种“超级细菌”之一。生物被膜的形成是金葡菌产生耐药性的重要原因。尽管金葡菌生物被膜形成的调控网络十分复杂,但根据胞外基质组分可将金葡菌生物被膜的调控途径分为三条,分别是多糖合成途径、蛋白质合成途径,以及eDNA合成途径。本课题组前期从我校某附属医院一脓毒症患者体内分离获得一株金葡菌,命名为XQ株。在体外连续培养时,获得一株颜色变白的新菌株,命名为XQW株。由于XQW株在液体培养基中呈絮状生长,推测其生物被膜形成能力可能有所增强。为了证实该假设,我们采用结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜检测并比较了XQ株与XQW株的生物被膜形成差异;通过全基因组测序,发现XQW株存在SigB(Q225P)突变;利用基因位点替换和回补菌株验证了SigB(Q225P)突变在金葡菌生物被膜形成中的作用。随后,利用RT-qPCR检测比较XQ株与XQW株生物被膜形成相关基因表达差异,发现耐热核酸酶基因nuc在XQW株中表达显著下降,可能影响金葡菌生物被膜形成,进一步通过lacZ报告系统和EMSA初步探讨了SigB(Q225P)调控金葡菌生物被膜形成的机制。主要内容和结果如下:1.SigB(Q225P)突变促进金葡菌生物被膜形成的作用研究(1)XQ株与XQW株的生物被膜形成能力比较。(1)从体外传代中获得的菌落颜色变白的XQW株在液体培养基中呈絮状生长,我们首先通过结晶紫染色法比较了XQ株与XQW株的生物被膜形成能力。结果表明,与XQ野生型相比,XQW株的生物被膜形成能力明显增强。(2)通过激光共聚焦显微镜观察XQ株与XQW株所形成的生物被膜,结果显示XQW株的生物被膜较XQ株厚而致密,表明XQW株的生物被膜形成能力较XQ株强。(2)SigB(Q225P)突变可能是XQW株生物被膜形成增强的重要原因(1)为探索XQW生物被膜形成增强的原因,我们对XQ株和XQW株进行了全基因组测序(XQ株基因组GenBank登录号:CP013137)。基因组比较发现,与XQ相比,XQW株的基因组DNA发生了527处点突变,其中392处突变导致了相应基因编码的氨基酸发生改变,可能影响161个基因的功能。根据XQW株颜色变白及生物被膜形成增强的表型,我们进一步利用BLAST比较了与金葡菌色素合成相关及与生物被膜形成有关的基因,结果发现XQW的sigB发生了点突变,该基因的第674位碱基由A突变为C,使得SigB蛋白第225位谷氨酰胺突变为脯氨酸(Q225P)。(2)sigB在金葡菌中的作用。已有文献报道,sigB基因在金葡菌中除了调控色素的合成之外,还具有调控毒力因子表达,促进生物被膜形成以及调节耐药性等多种生物学功能。通常,一个基因的突变可使该基因的功能丧失。据文献报道,sigB基因缺失株的生物被膜形成能力下降。然而,我们检测到的SigB(Q225P)是一种新发现的sigB突变,该突变可能使XQW株生物被膜的形成能力增强,这引起了我们深入探索SigB(Q225P)突变促进金葡菌生物被膜形成机制的兴趣。这一新的突变类型反而导致生物被膜形成能力增强。接下来我们希望探究SigB(Q225P)突变如何促进金葡菌生物被膜形成的机制。同时也可进一步检测SigB(Q225P)在不同的金葡菌中是否均能促进生物被膜的形成。(3)SigB(Q225P)促进金葡菌生物被膜的形成因XQ株为临床金葡菌分离株,遗传操作难以进行。为深入探究SigB(Q225P)突变在促进金葡菌生物被膜形成中的作用,我们利用金葡菌Newman进行遗传操作,构建相关突变菌株和回补菌株,检测它们的生物被膜形成差异,验证SigB(Q225P)突变在促进金葡菌生物被膜形成中的作用。(1)基因替换突变株Newman-sigB(Q225P)的构建。分别以XQW株、Newman株基因组为模板,扩增sigB上游及sigB(Q225P)序列,依次克隆到大肠埃希菌-金葡菌穿梭质粒p BT2中,构建pBT2-sigB(Q225P)。通过电转化将p BT2-sigB(Q225P)转入金葡菌RN4220中,并通过PCR和酶切进行验证。接着将经过RN4220修饰后的p BT2-sigB(Q225P)电转入金葡菌Newman中,根据pBT2对温度敏感的特性,我们筛选出疑似的Newman-sigB(Q225P),最后通过测序进行鉴定。测序结果显示基因替换突变株Newman-sigB(Q225P)构建成功。(2)基因敲除株Newman-△sigB的构建。以金葡菌Newman基因组为模板扩增sigB基因的上下游片段,依次将上下游片段克隆到p BT2中,获得p BT2-△sigB。再将p BT2-△sigB转化Newman,筛选获得Newman-△sigB。(3)回补菌株Newman-△sigB/sigB的构建。以金葡菌Newman基因组为模板分别扩增sigB-promoter、sigB序列,依次将片段克隆到大肠埃希菌-金葡菌穿梭质粒p LI50中,构建p LI50-sigB重组表达质粒。通过电转化将p LI50-sigB重组质粒转入金葡菌Newman-△sigB中,通过Western blot验证p LI50-sigB在Newman-△sigB中表达相应的SigB。(4)回补菌株Newman-△sigB/sigB(Q225P)的构建。分别以Newman、XQW基因组为模板扩增sigB-promoter、sigB(Q225P),依次将片段克隆到大肠埃希菌-金葡菌穿梭质粒p LI50中,构建p LI50-sigB(Q225P)。转化并获得回补菌株Newman-△sigB/sigB(Q225P)。(5)生物被膜形成能力检测。对Newman、Newman-sigB(Q225P)、Newman-△sigB/sigB、Newman-△sigB/sigB(Q225P)等菌株的生物被膜形成能力进行检测和比较。结晶紫染色法结果表明Newman-sigB(Q225P)基因替换突变株的生物被膜形成能力明显强于Newman野生型,该结果与在XQW株中的发现相一致。并且Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力强于Newman-△sigB/sigB。激光共聚焦显微镜检测也证实Newman-sigB(Q225P)的生物被膜形成能力较Newman野生型厚而致密。这些结果表明,sigB(Q225P)突变具有促进金葡菌生物被膜形成的作用。2.SigB(Q225P)促进金葡菌生物被膜形成的机制探讨(1)RT-q PCR检测并筛选XQW株生物被膜形成增强的相关基因。根据金葡菌胞外基质组分可将金葡菌的生物被膜调控网络分为三条途径,即胞外多糖合成途径、蛋白质合成途径,和eDNA合成途径。我们根据这三条途径筛选了nuc、fnbA、fnbB、clf A、icaA基因作为检测靶标。结果表明,与XQ株相比,XQW株的耐热核酸酶编码基因nuc的表达水平显著下降。作为降解生物被膜中主要成分eDNA的功能酶,nuc表达降低将促进eDNA的积累,有利于生物被膜形成。(2)SigB(Q225P)间接调控nuc基因的表达水平。为探索Sig(Q225P)下调nuc表达的分子机制,我们构建了nuc基因启动子控制的Lac Z报告质粒,分别转化Newman和Newman-sigB(Q225P),Lac Z活性检测结果显示nuc启动子在Newman-sigB(Q225P)中的活性较Newman野生株明显下降,表明SigB(Q225P)突变确实能影响nuc的表达。然而,进一步利用重组表达的SigB和SigB(Q225P)蛋白进行EMSA实验,结果并未显示SigB或SigB(Q225P)蛋白能与nuc启动子区直接结合。因此,我们推测SigB(Q225P)对nuc基因的表达调控是间接的。3.结论:SigB(Q225P)突变通过间接下调nuc表达水平从而促进金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。