论文部分内容阅读
目的：在制备抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体的基础上,观察其对大鼠心室肌细胞Na+/Ca2+交换电流以及L-型钙通道、钠通道、内向整流钾通道和瞬时外向钾通道电流的影响。方法：1.单克隆抗体的制备和纯化：用化学合成的Na+/Ca2+交换体α-2重复序列肽段(第840-877位氨基酸残基,其序列为algtsvpdtfaskvaatqdqyadasignvtgsnavnvf,简称α-2(840-877))主动免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,经阳性克隆筛选、亚克隆及腹水诱生等步骤制备抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体；利用抗原亲和纯化柱对抗体进行纯化,并对纯化后的抗体进行ELISA检测,确定抗体效价。2.大鼠心室肌细胞的分离：采用胶原酶法急性分离大鼠心室肌细胞。选用健康成年SD大鼠(体重250-300g),击昏放血,迅速开胸取出心脏,修剪后悬挂在Langendorff灌流装置上行主动脉逆行灌流,先用无钙台式液灌流8-10分钟,再用胶原酶液(胶原酶P)循环灌流15-20分钟,待心室变大、变软后剪下心室肌组织,置于KB液中剪碎,轻轻吹打并过滤后获得大鼠单个心室肌细胞,用于后续膜片钳实验。3.膜片钳全细胞记录：应用膜片钳全细胞技术,在电压钳模式下记录心肌细胞膜Na+/Ca2+交换电流(INa/Ca),观察抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体对INa/Ca的作用；并进一步观察它对L-型钙电流(ICa-L)、电压门控钠电流(INa)、内向整流钾电流(IK1)和瞬时外向钾电流(Ito)等心肌主要离子通道电流的影响,以明确单克隆抗体作用的特异性。膜电流的大小用电流密度(即单位膜电容的膜电流,pA/pF)表示。结果：1.杂交瘤细胞株的建立：ELISA法检测培养细胞上清,挑选阳性克隆,经阳性克隆筛选及连续三次亚克隆后,最终共获得能稳定分泌抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体的3株杂交瘤细胞,分别命名为1E7、2D2和3F10,其分泌的抗体分别简称为1E7、2D2和3F10抗体。2.单克隆抗体效价及浓度：ELISA检测结果显示,1E7、2D2和3F10抗体效价分别为1：243000、1：243000和1：81000。1E7、2D2和3F10抗体浓度分别为0.81mg/ml.0.86mg/ml和0.70mg/ml.3.抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体对大鼠心室肌细胞INa/Ca的影响全细胞膜片钳记录结果表明,1E7抗体和3F10抗体对INa/Ca均无明显作用,提示这两种抗体对Na+/Ca2+交换体均无生物活性。2D2抗体对INa/Ca具有剂量依赖性抑制作用：在10-40μg/mL浓度范围内,2D2抗体对大鼠心室肌细胞外向及内向INa/Ca均表现出剂量依赖性的抑制作用。当给予细胞10.20.40μg/mL的2D2抗体后,钳制电位在+50mV时的外向INa/Ca由给药前(3.54±0.09)分别降至(3.05±0.05)(P<0.05).(2.24±0.10)(P<0.01).(1.11±0.08)(P<0.01)pA/pF；钳制电位在-100mV时的内向INa/Ca由(-3.06±0.07)分别降至(-2.45±0.08)(P<0.05).(-1.54±0.05)(P<0.01).(-0.62±0.04)(P<0.01)pA/pF.4.3D2抗体在10-40μg/mL浓度范围内对成年大鼠心室肌细胞ICa-L、INa.IK1和Ito均未见明显作用(P>0.05)。结论：1.以化学合成的Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)肽段作为抗原,采用杂交瘤技术,可制备对Na+/ca2+交换体具有显著生物活性的抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体。2.在10-40μg/mL浓度范围内,抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体可特异性抑制大鼠心室肌细胞INa/Ca；在此浓度范围内,该抗体对ICa-L、INa.IK1和Ito均无明显影响。因此,抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体可为今后对Na+/Ca2-交换体功能研究提供一种较已知Na+/ca2+交换体化学抑制剂特异性更高的工具药。3.抗Na+/Ca2+交换体α-2(840-877)单克隆抗体对大鼠心室肌细胞INa/Ca具有特异性抑制作用,支持了a-2重复序列是Na+/Ca2+交换体发挥功能的关键部位。