论文部分内容阅读
昆虫的肠道分为前肠、中肠、后肠三部分。前肠位于消化道的前部,主要功能是将食物与消化液混合;中肠是消化和吸收营养物质的主要部位;后肠的主要功能是从食物残渣中吸收水分和无机盐。当前对昆虫中肠的研究工作比较多,发现中肠除了参与消化功能,还是免疫反应的重要场所,人们对中肠生理功能、发育和免疫反应方面的认识也日渐完善。但是,对于前肠和后肠的研究报道相对较少,除了上述功能外,是否具有其他作用尚不明了。由于昆虫前肠和后肠在食物消化及废物排泄等方面也具有非常重要的作用,因此有必要进一步研究前肠和后肠的功能。 本研究首先采用果蝇、家蚕、棉铃虫作为模型来研究昆虫前肠对植物酚类物质的代谢解毒分子机制。植物酚类物质是一类重要的次级代谢产物,对很多动物和昆虫来说,摄取高浓度的酚类物质会中毒。但在自然界中,植食性昆虫能够正常生长繁殖,说明昆虫中尚有未知的解毒机制。在研究中我们发现昆虫前肠有多酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)表达,中肠组织未检测到PPO表达,并且PPO可以分泌到前肠内容物中,被激活为活性形式的酚氧化酶(phenoloxidase,PO),与食物碎片结合。为了了解昆虫前肠PPO与植物酚类物质的解毒是否有关,我们对PPO活性缺失的突变体果蝇添食酚类物质,结果显示果蝇的存活率与野生型相比显著下降,表明PPO对植物酚类物质解毒至关重要。进一步研究表明,PO可以氧化多种植物酚类物质,如槲皮素、单宁、没食子酸、绿原酸、L-DOPA,还可以氧化茶叶提取物中的酚类物质。把L-DOPA作为模式底物添食给昆虫,发现鳞翅目昆虫摄取L-DOPA后,低水平的L-DOPA会被PO快速氧化为中间产物,如5,6-dihydroxyindole(DHI);过量添食L-DOPA产生的DHI可以直接从中肠转移到后肠或者通过血液吸收后再转移到后肠。在后肠内,DHI会被后肠PO进一步氧化。生物测定实验表明,由L-DOPA产生的DHI在体内是无毒的。由于自然条件下植物叶片中的酚类物质含量远低于实验中使用的剂量,因此,昆虫取食植物时,其酚类物质对昆虫不构成威胁。本研究表明,如果能够有效抑制前肠PO的活性,可帮助对害虫进行防治。 然后,以家蚕为模式生物研究了昆虫后肠的潜在功能。通过对正常家蚕后肠内容物进行蛋白质谱鉴定,检测到51个蛋白。这些蛋白中有一部分是消化酶,如氨肽酶N、丝氨酸蛋白酶、脂肪酶等;一部分蛋白和营养储存相关,如30K protein8,low molecular30kDa lipoprotein PBMHPC-23precursor。此外,后肠内容物中还有一些免疫相关蛋白存在,如PPO和beta-1,3-glucan recognition protein4precursor。由于后肠内容物中有很多消化酶,表明后肠除了维持机体水分和离子平衡的功能以外,还具有潜在的营养消化功能。 Bt(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白是一种针对中肠的有效生物杀虫剂,对昆虫后肠的影响没有文献报道。本实验研究发现,家蚕幼虫在摄取激活形式的Bt毒素蛋白Cry1Ab以后,后肠内容物会发生褐化反应,而非正常的黑色粪便。这说明Cry1Ab对家蚕后肠也有影响。通过蛋白质谱鉴定,发现喂食Cry1Ab的家蚕后肠内容物的蛋白组成与对照组相比差异很大,这些差异蛋白如丝氨酸蛋白酶抑制剂可能会帮助抵抗Cry1Ab的毒性。另外,通过切片观察,发现取食Cry1Ab的家蚕后肠隐肾管结构遭到破坏。昆虫后肠具有回收水分和无机盐的功能,隐肾管的破坏,导致后肠组织回收水分、无机盐功能失调,从而引起后肠发生褐色液体堆积。后肠内容物的褐化现象是家蚕对Bt毒素蛋白的一种应激反应。本研究结果是Bt对昆虫肠道功能影响的一项重要补充,说明通过生物化学方法破坏后肠功能是可行的。 总之,通过本研究发现,昆虫的前肠和后肠分别对毒性物质具有解毒或者应激反应。通过研究昆虫对植物酚类物质解毒机制,揭示了植食性昆虫对植物酚类物质的解毒是由前肠内的PPO介导。通过Bt毒素蛋白对昆虫后肠组织结构及代谢的研究,发现了Bt毒素蛋白不仅对中肠组织有影响,对后肠生理功能也有很大影响,是对Bt蛋白杀虫机理的重要补充,也为后肠作为靶标进行害虫防治提供了新的理论依据。