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随着规模化养牛业的不断发展,牛支原体(Mycoplasma bovis)成为危害养牛业的一种重要致病性支原体。血清学诊断是鉴定牛支原体感染的一种比较可靠的方法,然而目前商品化的血清抗体诊断试剂盒很少,它们对不同国家和地区差异菌株的诊断有待验证。另外,商品化的牛支原体疫苗也较少,并且只能提供暂时或部分的保护,某些情况下,全菌疫苗免疫还会加剧病症或存在其他严重的副作用。因此,为了给牛支原体诊断以及疫苗的研究提供尽可能多的抗原信息,本研究提取牛支原体分离株PD株的全细胞蛋白,利用免疫蛋白质组学技术筛选免疫原性蛋白;选取免疫反应性和重复性较好的蛋白对其基因进行克隆和表达,进而基于重组蛋白建立牛支原体血清抗体iELISA诊断方法;另外,用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,检测免疫指标以深入分析蛋白的免疫原性。结果表明,本研究成功鉴定了 19种与牛支原体阳性血清发生特异性免疫反应的蛋白,其中多数是酶类,属于细胞质蛋白,参与细胞生长、新陈代谢、信号转导以及生物信息的存储等过程,有的还与支原体黏附和入侵宿主细胞有关。从中选取免疫反应性强、重复性好的GAPDH、PDHB和FtsZ蛋白进行原核表达,利用蛋白序列相对更加保守的PDHB蛋白为包被抗原建立了 iELISA方法,通过比较发现,rPDHB-iELISA与试剂盒的检测一致性较好(kappa系数为0.783),当阳性血清稀释倍数为1:2560～1:10240, rPDHB-iELISA阳性检出率显著大于试剂盒(P<0.05)。将以上三种重组蛋白免疫BALB/c小鼠,同时设牛支原体全细胞提取物(Extracts)对照组,结果发现三种蛋白均可诱导产生IgG1和IgG2a亚类的抗体,其中FtsZ蛋白诱导产生的IgG1以及PDHB蛋白诱导产生的IgG2a抗体水平显著高于其他组;GAPDH和PDHB蛋白均可诱导小鼠分泌较高浓度Th1和Th2型细胞因子,FtsZ蛋白主要诱导Th2型细胞因子分泌;三个蛋白免疫组的CD3+CD4+T淋巴细胞百分比显著大于阴性对照组(P<0.05), PDHB和Extracts免疫组的CD3+CD8+T淋巴细胞百分比大于阴性对照组,差异不显著;体外刺激48h, GAPDH和PDHB蛋白免疫组特异性分泌IFN--γ的淋巴细胞数大于FtsZ蛋白组,并且显著大于Extracts组。总之,本研究基于牛支原体重组蛋白PDHB建立的iELISA检测方法比商品化试剂盒具有更高的检出率和灵敏度,更加适用于牛支原体血清抗体的检测;牛支原体FtsZ蛋白主要诱导Th2型免疫反应,PDHB蛋白可同时诱导较强的Th1型免疫反应。另外,FtsZ蛋白能够诱导较强的体液免疫反应,PDHB蛋白可同时诱导较强的特异性细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为牛支原体疫苗候选抗原的筛选提供参考。