左右体轴的建立是两侧对称动物器官发生和形态建成的重要组成部分,这一过程包含一系列错综复杂的发育调控网络,过去几十年调控两侧对称动物左右体轴建立的分子机制在多种模式动物中得以揭示。研究发现在文昌鱼和脊椎动物中左右体轴的建立受Cer-Nodal-Lefty-Ptix级联信号通路调控。除上述信号通路之外在后口动物小鼠、鸡和海胆中Hedgehog(Hh)信号通过调控Noal参与左右不对称的发育。在文昌鱼中,Hh基因最早不对称表达的时间远远晚于Noal基因,因此Hh信号通路是否参与文昌鱼左右不对称调控一直存在很多争议,最近本实验室的研究发现在文昌鱼中敲除Hh基因影响口前窝和鳃裂沿左右体轴的不对称排列,暗示Hh信号通路可能参与文昌鱼左右体轴的建立,但是Hh信号通路通过何种途径参与文昌鱼左右不对称建立还不清楚。本文通过原位杂交、组织切片和扫描电镜等技术对Hh基因敲除后胚胎表型进行了详细的分析,结果显示Hh敲除后文昌鱼口消失,口前窝出现在两侧,内柱和棒状腺变得左右对称,体节由交错排列变成左右对称排列从而使整个胚胎呈现左右对称的表型。相应器官的特异基因表达也呈左右对称的表达模式,说明Hh信号通路的确参与文昌鱼左右体轴发育,为了进一步研究Hh参与左右不对称建立机制我们检测了调控文昌鱼左右建立的关键基因Cer、NoAl、lefty和Pitx的表达,结果发现Hh敲除后Cer表达消失,Nodal、Lefty和Pitx表达变得左右对称,另外在Hh突变体胚胎中重新注射Hh mRNA能够完全挽救Hh敲除造成的表型。根据以上结果,结合本课题组关于Cer基因敲除突变体的相关研究,认为在文鱼中Hh通过调控Cer表达参与左右体轴的建立。为了进一步了解Hh调控Cer表达的具体机制以及Hh是否参与Cer基因左右对称的最初打破,我们在文昌鱼Cer基因的启动子区发现了 Hh信号通路转录因子Gli的结合位点,但是荧光素酶实验结果显示该位点的突变与否并不影响下游报告基因的表达,说明在文昌鱼中Hh可能不是通过“Hh-Gli-Cer”方式参与Cer调控的。除此之外分析了Hh、Ptch和Cer在胚胎发育早期详细的表达谱,发现在Cer开始不对称表达时期Hh和Ptch均呈左右对称的表达模式,不仅如此我们还检测了Hh上调和异位表达时Cer的表达情况,结果发现Cer基因的表达模式均没有改变。综合以上结果表明Hh可能并不参与文昌鱼Cer基因的不对称表达调控。为了探究Nodal信号通路与Cer基因表达的关系,我们分别检测了上调Nodal信号通路和抑制Nodal信号通路后Cer基因的表达情况,结果显示上调Nodal信号通路后Cer表达显著上调,抑制Nodal信号通路后Cer表达消失,说明Cer的表达受Nodal信号通路调控,有意思的是在不同时期抑制Nodal信号通路对Cer表达的影响不同,在囊胚时期抑制Nodal信号通路,Cer表达显著下调;在原肠胚中期抑制Nodal信号通路Cer表达呈两侧对称。说明Nodal信号通路也参与Cer左右不对称的表达调控。Hh信号通路除了在文昌鱼左右体轴建立过程中起作用,还发现Hh以及Smo敲除后文昌鱼口不能形成,暗示Hh信号通路在文昌鱼口形成中也扮演重要功能,为了进一步探究Hh在口形成中的功能,我们检测了 Hh信号通路上调后文昌鱼口的发育情况,结果显示注射Hh mRNA或者敲除Ptch基因后文昌鱼开口变大。此前的研究发现文昌鱼口的形成受Nocdal-Ptix信号通路调控,为进一步验证Hh和Nodal信号通路在口形成中的关系,我们检测了 口部标记基因Pou4和Pax2/5/8在口不同发育时期的表达情况,结果发现Hh敲除后上述基因在口形成初期口原基处的表达没有变化,在开口时期表达消失,说明Hh信号通路只参与文昌鱼开口过程的调控,而不参与口原基的形成。