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实验目的：从细胞增殖、细胞周期及血管生成三个方面进一步探讨贝伐单抗、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)抑制裸鼠结直肠癌移植瘤生长的作用机制。实验方法：1.采用MTT法检测人结直肠癌HT-29细胞株增殖情况：体外培养人结直肠癌HT-29细胞株,分别予以5-FU、贝伐单抗单药或两者联合进行干预,继续培养24、48、72、96h,酶联免疫检测仪测定HT-29细胞在490nm处的光吸收(OD)值,采用单因素方差分析(LSD法)比较各实验组及实验组与对照组间细胞增殖情况。从中选出5-FU、贝伐单抗的最适宜药物浓度,用于进一步探讨5-FU、贝伐单抗对HT-29细胞细胞周期分布的影响。2.采用流式细胞仪检测人结直肠癌HT-29细胞细胞周期的分布：体外培养HT-29细胞,分别观察予以5-FU、贝伐单抗及联合用药进行干预,继续培养48h后,流式细胞仪检测HT-29细胞细胞周期各时相的百分比,分析5-FU、贝伐单抗单药及联合应用对HT-29细胞细胞周期的影响。3.采用免疫组化法检测裸鼠结直肠癌移植瘤组织与VEGFR结合的VEGF表达及微血管生成情况：将前期动物实验中瘤内注射生理盐水(对照组)、贝伐单抗、5-FU及贝伐单抗联合5-FU治疗后所得裸鼠结直肠癌移植瘤组织制成蜡块,用免疫组化法分别检测结直肠癌移植瘤组织VEGF及CD31的表达,并计算CD31标记的微血管密度。采用χ2检验比较各实验组和对照组间与VEGFR结合的VEGF阳性表达情况,采用独立样本t检验比较各实验组与对照组间肿瘤微血管密度,分析贝伐单抗、5-FU单药及联合应用对裸鼠结直肠癌移植瘤血管生成的影响。实验结果：1.5-FU、贝伐单抗单药及两者联合均可抑制人结直肠癌HT-29细2.胞株增殖。(1)5-FU可有效抑制HT-29细胞株增殖,显示出剂量依赖性和时间依赖性,且随5-FU作用时间延长其时间依赖性逐渐减小。不同浓度5-FU组OD值比较,差异有统计学意义(24、48、72、96h P值均为0.000)；5-FU各组OD值与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)贝伐单抗对HT-29细胞株增殖抑制作用较弱,显示出一定的时间依赖性。不同浓度贝伐单抗组OD值比较,差异有统计学意义(24、48、72、96h P值均为0.000)；0.1ug/ml组OD值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其他各组OD值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；其中10ug/ml组与80ug/ml对HT-29细胞增殖抑制作用相对显著,24、48、72、96h细胞生长抑制率分别为14.11%vs12.38%、14.34%vs14.21%、17.47%vs18.38%、24.58%vs25.18%。(3)贝伐单抗联合5-FU可显著抑制HT-29细胞株增殖,显示出时间依赖性和剂量依赖性,且随两种药物作用时间的延长,其时间依赖性及剂量依赖性均逐渐减小。联合用药各组OD值比较,差异有统计学意义(24、48、72、96h P值均为0.000),各实验组OD值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与5-FU单药比较,联合用药可提高HT-29细胞生长抑制率,差异有统计学意义(P<0.05),提示贝伐单抗联合5-FU具有协同抑制HT-29细胞增殖作用。3.5-FU、贝伐单抗单药及联合应用对HT-29细胞细胞周期均有影响：5-FU可抑制HT-29细胞周期中G1-S期的过程,表现为G1期细胞百分比增多,S期细胞百分比减少；贝伐单抗对HT-29细胞周期分布的影响不明显,以G2期细胞百分比减少为特征；联合用药能够同时发挥两种药物的抑制优势,表现为HT-29细胞停滞于G1期,S期和G2期细胞百分比均减少。4.瘤内注射贝伐单抗可有效抑制裸鼠结直肠癌移植瘤组织与VEGFR结合的VEGF表达及微血管生成,与5-FU联合对与VEGFR结合的VEGF表达及微血管生成的抑制作用进一步增强。结果显示：对照组、5-FU组、贝伐单抗组及联合用药组结直肠癌移植瘤组织中与VEGFR结合的VEGF阳性细胞百分比分别为27.85±1.47%、28.52±1.77%、10.41±1.62%、4.43±1.65%。采用χ2检验进行统计学分析,贝伐单抗组及联合用药组与对照组比较,差异均有统计学意义(P值均为0.000),联合用药组与贝伐单抗组比较,差异有统计学意义(P=0.000),5-FU组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。5. Weidner法计算微血管密度结果显示,对照组、5-FU组、贝伐单抗组及联合用药组结直肠癌移植瘤微血管密度分别为56.78±4.964、50.78±3.190、35.80±5.136、21.71±7.175,采用独立样本t检验进行统计学分析,贝伐单抗组及联合用药组微血管密度与对照组比较差异有统计学意义(P值均为0.000),联合用药组微血管密度与贝伐单抗组比较,差异有统计学意义(P=0.000),5-FU组微血管密度与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.5-FU、贝伐单抗均可抑制人结直肠癌HT-29细胞株增殖,两者联合可使HT-29细胞株增殖抑制率增高。2.5-FU、贝伐单抗能够协同影响人结直肠癌HT-29细胞细胞周期分布,5-FU主要作用于G1-S期,贝伐单抗可抑制S-G2期。3.瘤内注射贝伐单抗能够抑制裸鼠结直肠癌移植瘤组织与VEGFR结合的VEGF表达及降低结直肠癌组织微血管密度,与5-FU联用使其作用进一步增强。