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背景与目的:足细胞损伤与肾小球疾病的发生发展密切相关,本实验采用的嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导大鼠肾病模型(PAN肾病模型)与PAN体外诱导足细胞凋亡为两个经典的足细胞损伤模型,广泛用于足细胞损伤研究当中。由我们的合作方美国刘宏宇教授课题组研发的DYYG化合物(C16H12N8O.HCL)是甲基并咪唑-噁二唑-吡啶并咪唑的衍生物的盐酸盐,是一种新型小分子化合物,其分子量为368。我们前期研究发现DYYG化合物对于足细胞损伤模型具有显著修复作用,该论文主旨为探讨DYYG化合物是否通过PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导足细胞自噬,产生对PAN肾病足细胞损伤的修复,从而对肾脏起保护作用。方法:第一部分:体外培养足细胞实验:分为CON组、DYYG组、PAN组、PAN+DYYG组,按分组条件培养24小时,Western blot、免疫荧光方法观察PAN诱导足细胞损伤后,DYYG对其标志蛋白表达的影响。流式细胞仪检测DYYG对PAN诱导足细胞凋亡的影响。第二部分:体外培养足细胞实验:分为CON组、DYYG组、PAN组、PAN+DYYG组、PAN+DYYG+3-MA组、3-MA组,按分组条件培养24小时,应用共聚焦显微镜观察DYYG对m RFP-GFP-LC3腺病毒转染足细胞自噬的影响,透射电镜下观察足细胞内自噬体数目的变化,Western blot检测足细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62的表达水平。第三部分:60只雄性SD大鼠随机分为CON组、PAN组,PAN+DYYG组,PAN+TAC组,每组15只,构建PAN肾病模型。于0、7、14、21、28天,分五批处死动物,12只/次,测每个时间点24小时尿量、尿蛋白定量、血Cr、血BUN。免疫组织化学方法检测DYYG对PAN肾病模型肾小球足细胞标志蛋白Podcin表达的影响。免疫荧光方法共聚焦显微镜下观察DYYG对PAN肾病模型肾小球足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin表达的影响。透射电镜下观察DYYG对PAN肾病模型肾小球足细胞病理结构的影响。第四部分:Western blot明确DYYG对PAN肾病模型足细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62以及PTEN、PI3K、Akt及其下游m TOR信号分子表达的影响。结果:第一部分:按分组条件培养足细胞24小时后,Western blot结果发现,与CON组相比,PAN组足细胞标志蛋白Synaptopodin、Nephrin、Podcin、ZO-1蛋白表达下调(均P<0.05)。与PAN组相比,PAN+DYYG组足细胞标志蛋白Synaptopodin、Nephrin、Podcin、ZO-1蛋白表达上调(均P<0.05),而DYYG组与CON组相比则无明显差异。免疫荧光方法结果显示,PAN组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin荧光强度显著低于CON组,Synaptopodin丝状结构破坏,皱缩于核周表达。PAN+DYYG组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin荧光强度显著高于PAN组。而DYYG组与CON组相比则无明显差异。流式细胞仪检测结果发现,与CON组相比,PAN组足细胞凋亡比例明显增加(均P<0.05),与PAN组相比,PAN+DYYG组足细胞凋亡比例明显降低(均P<0.05),而DYYG组与CON组相比则无明显差异。第二部分:应用共聚焦显微镜观察DYYG对m RFP-GFP-LC3腺病毒转染足细胞自噬的影响,结果显示,CON组足细胞内见红色斑点及黄色斑点表达。与CON组相比,PAN组足细胞红色斑点及黄色斑点聚集数量明显减少(P<0.05)。与PAN组相比,PAN+DYYG组足细胞红色斑点及黄色斑点聚集数量明显增加(P<0.05)。经3-MA预处理1小时后再给予PAN+DYYG,DYYG恢复足细胞自噬的作用减弱(P<0.05)。DYYG组、3-MA组与CON组相比则无明显差异。透射电镜下观察足细胞内自噬体数量,结果显示,与CON组相比,PAN组足细胞自噬体数量明显减少(P<0.05)。与PAN组相比,PAN+DYYG组足细胞自噬体数量明显增加(P<0.05)。DYYG组、3-MA组与CON组相比则无明显差异。经3-MA预处理1小时后再给予PAN+DYYG,足细胞内自噬体数量无增加。Western blot检测足细胞自噬相关蛋白的表达水平均验证上述实验结果,表明DYYG可增强PAN诱导足细胞损伤模型的自噬水平,从而达到足细胞保护作用。第三部分:成功建立SD大鼠PAN肾病模型,第7天PAN组、PAN+DYYG组、PAN+TAC组与CON组相比大鼠体重未见明显变化,差异无统计学意义(均P>0.05)。第14天、第21天及第28天CON组、PAN+DYYG组及PAN+TAC组与PAN组比较,大鼠体重逐渐增加,差异有统计学意义(均P<0.05),PAN+DYYG组与PAN+TAC组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。第7天,PAN组、PAN+DYYG组、PAN+TAC组与CON组比较大鼠尿量明显减少,出现蛋白尿,血Cr及血BUN值明显升高(均P<0.05)。第14天,PAN组、PAN+DYYG组、PAN+TAC组与CON组比较大鼠尿量明显减少,24小时尿蛋白定量、血Cr及血BUN值较第7天降低,而PAN+DYYG组、PAN+TAC组与PAN组比较,24小时尿蛋白定量、血Cr及血BUN值降低更明显(均p<0.05)。第21天、第28天,PAN组、PAN+DYYG组、PAN+TAC组24小时尿蛋白定量、血Cr及血BUN浓度逐渐降低,与PAN组比较,PAN+DYYG组、PAN+TAC组降低更明显,24小时尿量明显增加,PAN+DYYG组与PAN+TAC组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。免疫组织化学方法检测PAN组足细胞标志蛋白Podcin表达显著低于CON组,PAN+DYYG组及PAN+TAC组足细胞标志蛋白Podcin表达显著高于PAN组,两者相比则无明显差异(P>0.05)。免疫荧光方法共聚焦显微镜结果显示,PAN组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin荧光强度显著低于CON组,PAN+DYYG组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin荧光强度显著高于PAN组。而DYYG组与CON组相比则无明显差异。透射电镜结果显示,PAN注射第7天,PAN肾病模型组,足突融合,溶酶体坏死,肾间质水肿,PAN肾病给予DYYG、TAC治疗组,足突增宽,肿胀。PAN注射第14天,PAN肾病模型组,病变更加严重,足突广泛融合,部分足突消失,而给予DYYG、TAC治疗组,与第7天比较,足突形态好转,但两者未见明显差异。PAN注射第21天,PAN肾病组及给予DYYG、TAC治疗组,足突肿胀,融合好转,与PAN肾病模型组相比,给予DYYG、TAC治疗组好转更明显,与CON组足突结构相似,但两者未见明显差异。PAN注射第28天,给予DYYG、TAC治疗组足突形态结构恢复正常,但PAN肾病模型组足突宽度仍高于CON组。通过对足突超微结构的观察,与PAN肾病模型组相比,给予DYYG、TAC治疗组足突融合程度明显低于PAN肾病模型组,DYYG、TAC可以改善和逆转足突形态改变。第四部分:Western Blot方法结果显示:PAN组足细胞内PTEN蛋白表达量下调,PI3K、p Akt、m TOR表达量明显增加,LC3Ⅱ、Beclin表达下调;P62蛋白表达量增加,信号通路蛋白及自噬相关蛋白表达量与CON组相比,差异有统计学意义(均P<0.05)。与PAN组比较,PAN+DYYG组足细胞PTEN表达上调,PI3K、p Akt、m TOR表达下调;LC3Ⅱ、Beclin表达上调;P62蛋白表达量减少,信号通路及自噬相关蛋白表达量与PAN组相比,差异有统计学意义(均P<0.05)。而PAN+LY294002组,PI3K抑制剂LY294002可抑制PI3K、p Akt、m TOR表达,上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin,下调P62表达(均P<0.05),但对PTEN表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本研究证实PAN可抑制足细胞自噬,诱导足细胞损伤。DYYG干预可减轻PAN诱导的足细胞自噬抑制,增强足细胞自噬,改善足细胞损伤,其保护机制可能是通过上调PTEN表达,抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路活化而实现的。