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趋化因子(chemokines)是一类分子量为8～12kD蛋白，属于细胞因子超家族，能够趋化中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等多种细胞，参与免疫及炎症反应。除广泛参与各种炎症反应、免疫应答、血管形成、病毒感染等多种生理和病理过程外，趋化因子还能调节造血干细胞、前体细胞的归巢、迁移和动员等过程，直接抑制或参与促进造血干细胞、前体细胞的增殖，影响干细胞或前体细胞存活，从而显示出造血调控作用。随着趋化因子受体、信号转导途径研究的深入，趋化因子的造血调控作用越来越受到重视。但多数趋化因子表现为造血负相调控作用，具有正相造血调控作用的趋化因子很少，目前已知的仅有SDF-1、MIP-3β以及SLC这几种。若能发现具有正相造血调控作用的趋化因子，将不仅具有理论意义，还具有重要的临床应用前景。 巨噬细胞炎性蛋白2_γ(Macrophage inflammatory protein 2_γ，MIP-2_γ)是本室通过大规模随机测序，从自行建立的人外周血树突状细胞(Dendritic cells，DCs)的cDNA文库中独立发现的一种新的CXC类趋化因子(Cao X et al.The Journal of Immunology，2000，165：2588-2595)。MIP-2_γ全长cDNA为463bp，所编码蛋白的N端含有34个氨基酸组成的信号肽，成熟分子由77个氨基酸组成，蛋白水平与趋化因子MIP-2α/β有160％的同源性。我们前期的研究发现，基因重组人MIP-2_γ在体外能促进CFU-GM的形成，提示其可能参与造血调控。 本课题分三部分内容：1．MIP-2_γ维持造血干细胞存活的作用及相关的信号传导机制研究；2．MIP-2_γ对造血干细胞的体外趋化和体内动员作用及其相关机制研究；3．MIP-2_γ体内应用对放疗引起的造血损伤的治疗作用及相关机制研究。通过本研究，有助于深入认识新型趋化因子MIP-2_γ所具有的造血调控功能并为其将来可能的临床应用奠定实验和理论依据。第二军医大学博士学位论文中文摘要第一部分MIP一2Y维持造血干粗细胞存活的作用及相关的信号传导机制研究 造血干/祖细胞是机体中具有高度自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞，其存活和生长需要一些细胞因子和生长因子的存在，一旦离开细胞因子和生长因子，将引起干细胞和前体细胞的凋亡。近年来的研究发现，大多数参与炎症及免疫反应的趋化因子是造血负相调控因子，可以抑制髓系前体细胞增殖和存活，部分趋化因子则对造血前体细胞的增殖没有影响。即使是对造血干细胞具有趋化作用的SDF一1也仅仅能维持髓系前体细胞的存活，而不能促进其增殖。由于MIP一2y在体外能促进cFU一GM的形成，因此，我们推测MIP一2Y可能是一种正相造血调节因子，能够影响造血干/祖细胞的增殖和存活能力。 利用磁珠分离方法，分离得到小鼠骨髓来源的干/祖细胞(Lin一sca一1+cDll7+)和人CD34+造血干/祖细胞，观察MIP一2Y对其增殖和存活的影响。结果显示，经MIP一2Y单独培养72小时的Lin一Sca-1十CD 1 17+和CD34+干/祖细胞MTs掺入量明显较对照组增高，表明，hnP一ZY很可能影响了这些细胞的增殖或存活，进一步对这些细胞的数量和活细胞比例的检测表明，这些细胞的总数未有明显变化，但其中活细胞的比例明显较对照组增高。以上结果表明，M，一ZY单独作用能够维持造血干/祖细胞的存活，但不能促进其增殖。 为了进一步验证M正一2Y的这种作用，我们体外分离了小鼠骨髓细胞，加入M正一2Y孵育，24小时后加入含有生长因子的甲基纤维素培养基培养，7天后计数CFU一GM、CFU一GEMM(CFU一Mix)集落，评价Mlp一2丫对前体细胞的存活的影响。结果显示，M护一ZY能够显著维持前体细胞的存活，其作用与GM一CSF一致。 我们还检测了M护一2Y对细胞株TF一1、KGI、KGla和Mo7e增殖反应的影响。结果显示M伊一2Y能够促进TF一1、KGI的增殖，且其中对TF一1的促增殖作用最强，对KGla和Mo7e的增殖无明显促进作用。该结果为应用这些细胞株分析MIP一2Y作用的信号传导机制提供了合适的实验模型。 我们进一步检测了M正一2Y维持造血干/祖细胞存活的信号传导机制。考虑到趋化因子受体G蛋白偶联受体，特异性结合趋化因子介导细胞内的信号传递，已知多 第二军医大学博士学位论文中文摘要种G蛋白参与趋化因子受体介导的信号传递，包括百日咳毒素敏感(pe血5515 toxinsensitive，pTX)G蛋白(Gai)、百日咳毒素不敏感Gaq和G15/16。将p仪与人cD34+造血干/祖细胞预孵育后明显抑制了MIP一2Y维持细胞存活的作用，提示MIP一2Y也是通过Gai偶联受体发挥其作用。 趋化因子与G蛋白偶联受体相互作用后活化多种信号途径。选择不同信号途径的抑制剂与干/祖细胞预孵育，观察不同信号途径的特异性抑制剂对MIP一2Y维持干/祖细胞存活的抑制作用。结果显示，PI3K信号途径特异性抑制剂LY294002(30协M)可以非常显著地抑制CD34+细胞的存活，阻断M伊一2丫对en34+和TF一z细胞存活的促进作用。ERK抑制剂PD98059(20林M)、p38 MApK抑制剂sBZo358o(20卜M)和NF一kB抑制剂Cureuma(50林M)均不同程度的部分抑制了MIP一2Y诱导的CD34+造血干/祖细胞和TF一1细胞存活。 Westem?