目的:肝脏是机体内胆固醇代谢最重要的器官,那么,2型糖尿病状态下肝脏中胆固醇含量如何?胰岛素抵抗是2型糖尿病的发病基础,在单纯胰岛素抵抗状态下,肝脏的胆固醇含量如何?肝胆固醇的含量取决于外周胆固醇逆转运至肝脏的量、肝细胞自身合成的量以及胆固醇转化的量之间的平衡。逆转运是将肝外组织细胞的胆固醇通过血循环转运至肝脏。肝组织的SR-BI(Scavenger Receptor Class B Type I,清道夫受体)作为载运胆固醇酯化的高密度脂蛋白的受体,SR-BI选择性摄取高密度脂蛋白携带的胆固醇入肝,SR-BI表达的量影响逆转运至肝脏中胆固醇的量。肝细胞可利用乙酰CoA为原料合成胆固醇。其合成途径的限速酶是羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMG- CoA还原酶),该限速酶mRNA表达的量影响了胆固醇合成的量。肝脏可利用胆固醇合成胆汁酸,其限速酶是CYP7A1(胆固醇7α羟化酶),CYP7A1表达的量影响了胆固醇合成胆汁酸的量,从而影响细胞的胆固醇水平。ABCG5(三磷酸腺苷结合蛋白G5)、ABCG8(三磷酸腺苷结合蛋白G8)促进胆固醇排向胆汁,该基因表达的量影响细胞的胆固醇水平。肝X受体(Live X receptor,LXR,核受体转录因子)是胆固醇代谢的感受器,被其配体激活后,先与维甲酸X受体(Retinoid X Receptor,RXR)形成异二聚体,再作用到下游基因的顺式元件,通过调控其下游基因CYP7A1、ABCG5、ABCG8等的表达,调节肝中胆固醇的水平。LXR有两种亚型LXRα和LXRβ,在肝中均有表达。在胰岛素抵抗和糖尿病状态下,LXRα和LXRβ的表达如何变化?本实验以Sprague-Dawley(SD)大鼠为对象,采用高脂饮食复制胰岛素抵抗模型,在胰岛素抵抗基础上,腹腔注射小剂量STZ,复制2型糖尿病模型。观察在胰岛素抵抗和糖尿病状态下,大鼠肝脏胆固醇水平及HMGR、SR-BI、ABCG5、ABCG8、CYP7A1、LXRα、LXRβ基因mRNA水平。为探讨胰岛素抵抗和糖尿病状态肝胆固醇代谢异常的分子原因提供实验依据。方法:1动物分组及取材:参照Storlien的造模方法,采用本室戴冬雪等人复制成功的胰岛素抵抗及2型糖尿病大鼠模型,大鼠血清,用于血糖、血胆固醇的测定;肝组织,用于做肝胆固醇的测定及提取总RNA。2血糖的测定用HITACHI 7170A型全自动生化分析仪,采用葡萄糖氧化酶法测定血糖。3肝组织总胆固醇含量的测定对肝组织总胆固醇进行抽提后,对抽提液用胆固醇氧化酶法,用总胆固醇试剂盒来测定。4肝组织有关基因mRNA表达的测定用Promega总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。以18S rRNA做内参,real-time PCR测定LXRα、LXRβ、CYP7A1、ABCG5、ABCG8、SR-BI基因在mRNA水平的变化。5数据处理所有数据均用?x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,对测定结果进行正态性及方差齐性检验,糖尿病组、胰岛素抵抗组分别与对照组做比较,做两个独立样本t检验(双尾),检验以P < 0.05为差异有统计学意义。结果:1造模采用经典高脂饮食加上STZ复制动物模型,采用戴冬雪等人造模成功的动物模型,分别用OGTT试验和空腹血糖实验验证胰岛素抵抗模型成立和糖尿病模型成立。2肝组织胆固醇的变化(mg/100 g tissue)对照组为225.96±28.21,单纯胰岛素抵抗组为346.48±71.02,糖尿病组为212.03±20.73。单纯胰岛素抵抗组与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组肝组织胆固醇显著性增加(P < 0.01);糖尿病组与对照组相比,糖尿病组肝组织胆固醇没有显著性降低(P > 0.05)。结果表明,单纯胰岛素抵抗状态下,肝组织胆固醇水平异常。3待测基因mRNA相对表达量的变化3.1 LXRαmRNA的相对表达量对照组为59.00±9.67,单纯胰岛素抵抗组为73.61±18.28,糖尿病组为75.10±15.12。LXRα的相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组mRNA相对表达显著性增加(P < 0.05);糖尿病组mRNA相对表达显著性增加(P < 0.01)。把处理的对照组看做1,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组的相对表达量是1.27,糖尿病组的相对表达量是1.29。结果表明,单纯胰岛素状态下及糖尿病状态下,LXRαmRNA的表达显著性增加。3.2 LXRβmRNA的相对表达量对照组为28.46±7.98,单纯胰岛素抵抗组为30.53±4.84,糖尿病组为32.69±8.17。LXRβmRNA的相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均没有显著性增加(P > 0.05)。把处理的对照组看作1,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组相对表达是1.15,糖尿病组相对表达是1.18。结果表明,单纯胰岛素状态下及糖尿病状态下,肝中LXRβmRNA的相对表达量不变,并且低于LXRα的相对表达量。3.3肝胆固醇代谢相关酶基因表达变化3.3.1 SR-BI mRNA的相对表达量对照组9.60±2.70,单纯胰岛素抵抗组为17.79±4.45,糖尿病组为18.58±4.05,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组SR-BI mRNA的相对表达量均显著性增加(P < 0.01)。把处理的对照组看作是1,单纯胰岛素抵抗组相对表达量是2.17,糖尿病组的相对表达量是2.20。单纯胰岛素抵抗状态下及糖尿病状态下,SR-BI的相对表达量增加,选择性摄取高密度脂蛋白中酯化胆固醇增多,则外周胆固醇转运到肝脏代谢的越多。3.3.2 HMGR mRNA的相对表达量对照组为13.58±2.42,单纯胰岛素抵抗组为25.28±6.32,糖尿病组为32.75±7.23,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组HMGR mRNA的相对表达量均显著性增加(P < 0.01)。把处理的对照组看作是,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组相对表达量是1.97,糖尿病组相对表达量是2.46。单纯胰岛素抵抗状态下及糖尿病状态下,肝细胞中胆固醇合成途径的限速酶HMGR mRNA的相对表达量增多,反映肝脏中胆固醇的合成增多。3.3.3 CYP7A1 mRNA的相对表达量对照组为42.69±10.80,单纯胰岛素抵抗组为51.98±4.22,糖尿病组为69.65±20.69,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组CYP7A1 mRNA的相对表达量显著性增加(P < 0.01)。把处理的对照组看作是1,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组相对表达量是1.26,糖尿病组相对表达量是1.62。CYP7A1是胆固醇合成胆汁酸经典途径的限速酶,所得结果反映了单纯胰岛素抵抗状态下及糖尿病状态下,肝胆固醇转化为胆汁酸的速度增加。3.3.4 ABCG5 mRNA的相对表达量对照组为6.90±1.53,单纯胰岛素抵抗组为8.59±1.81,糖尿病组为12.52±3.09,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组ABCG5 mRNA的相对表达量显著性增加(P < 0.05),糖尿病组ABCG5 mRNA的相对表达量显著性增加(P < 0.01)。把处理的对照组看作是1,单纯胰岛素抵抗组相对表达量是1.37,糖尿病组相对表达量是1.97。ABCG5直接促进胆固醇排向胆汁,结果反映了在单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组状态下,胆固醇直接排向胆汁的量增加。3.3.5 ABCG8 mRNA的相对表达量对照组为1.16±0.30,单纯胰岛素抵抗组为1.54±0.31,糖尿病组为3.58±0.38,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组mRNA的相对表达均显著性增加(P < 0.01)。把处理的对照组看作1,单纯胰岛素抵抗组相对表达是1.46,糖尿病组相对表达是3.41。ABCG8直接促进胆固醇排向胆汁,结果反映了在单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组状态下,胆固醇直接排向胆汁的量增加。结论:1糖尿病状态下,肝组织胆固醇含量不变,与肝HMGR、SR-BI mRNA高表达和ABCG5、ABCG8、CYP7A1 mRNA高表达有关。2单纯胰岛素抵抗状态下,肝组织胆固醇的增加,与肝HMGR、SR-BI mRNA高表达的程度大于ABCG5、ABCG8、CYP7A1 mRNA高表达的程度有关。3糖尿病状态下,LXRα的表达增加,且可能被激活。