【研究背景】膀胱癌是全球第十大最常见的癌症和我国发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤。膀胱癌复发、进展率高,临床预后差。目前,包括免疫检查点PD1/PD-L1抑制剂在内的免疫治疗为膀胱癌患者带来了新的希望。至今,已有5种PD1/PD-L1抑制剂被批准用于局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的治疗,但遗憾的是其中仅有小部分患者对PD1/PD-L1抑制剂治疗有反应,客观缓解率仅为15%-24.4%。如何增强PD1/PD-L1抑制剂对膀胱癌患者的疗效,让更多患者受益,是当前需要进一步解决的问题,而联合免疫治疗为此提供了一种改进策略。PD-L1是肿瘤细胞表面“找不到我”的信号,是一种适应性免疫检查点,而CD47则是肿瘤细胞表面“不要吃我”的信号,是一种先天性免疫检查点,PD-L1和CD47在膀胱癌细胞表面均高表达。其中,CD47在超过80%的膀胱癌细胞上表达,而其表达水平在膀胱肿瘤干细胞中更高。在蓝光膀胱镜检查中使用荧光标记的CD47抗体诊断膀胱癌的敏感性和特异性分别为82.9%和90.5%,抗CD47单克隆抗体可通过阻断CD47抑制信号使巨噬细胞体外吞噬膀胱癌细胞。因此,将抗CD47单抗与抗PD-L1单抗联用,有希望能有效增强抗PD-L1单抗的疗效,减少膀胱癌的复发和进展,改善膀胱癌患者预后。既往实验研究表明,通过联合使用分别抗PD-L1和CD47的单克隆抗体或者应用抗PD-L1和CD47的融合蛋白,相较于单种抗体,均可显著增强对乳腺癌和结肠癌小鼠模型的抗肿瘤作用。但是,不管是抗体联用还是双特异性融合蛋白,均是单个抗体,瘤内富集程度较低,副作用相对较大,限制了抗体联合治疗的效果。纳米药物可通过增强渗透和滞留效应增加其在肿瘤内的富集,而加载其上的不同抗体则可实现主动靶向和协同抗肿瘤作用。因此,可以通过纳米技术将多个不同的单克隆抗体连接成一个整体,充分发挥不同抗体的靶向和治疗作用,实现相比于游离抗体联用更好的抗肿瘤效果。【研究目的】利用纳米技术,构建一种同时聚焦改善先天性免疫抑制和适应性免疫抑制的纳米免疫团簇,并对其体内外抗膀胱癌作用和相关作用机制进行探究,为膀胱癌治疗提供一种新的思路和选择。【研究方法】1.通过流式细胞术检测比较人膀胱上皮永生化细胞株SV-HUC-1和人膀胱癌细胞株5637、HT-1376、T24细胞表面CD47和PD-L1的表达水平;用小鼠MBT2膀胱癌细胞株经皮下注射,构建C3H/He N小鼠皮下膀胱癌模型,提取原代肿瘤细胞,通过流式细胞术进一步对MBT2细胞和原代肿瘤细胞表面CD47和PD-L1表达水平进行检测比较。2.在抗体巯基化的基础上,通过异双官能团修饰剂将抗CD47抗体和抗PD-L1抗体连接至分子量为750 k Da的支化型聚乙烯亚胺(PEI)载体上,构建抗CD47和PD-L1双靶向纳米免疫团簇(NCPC)。通过SDS-PAGE、Zeta电位测定验证抗体与PEI之间的成功连接。通过动态激光散射仪测定其粒径。通过原子力显微镜观察其3D形貌。通过CCK-8实验评估载体及其中间产物的生物相容性。3.体外功能试验中:通过荧光二抗标记法评价和比较了纳米免疫团簇NCPC和抗CD47抗体与抗PD-L1抗体联用(CPB)与细胞表面抗原的结合和解离能力;比较分析了NCPC和CPB对膀胱癌细胞的毒性作用和凋亡影响、促巨噬细胞吞噬作用和促肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lyphocytes,TIL)肿瘤杀伤作用。4.对未处理和经CPB、NCPC处理后的5637膀胱癌细胞进行转录组测序,以及进一步的生物信息学分析,探究纳米免疫团簇NCPC对膀胱癌的可能作用机制。5.采用原子力显微镜从形态学和力学角度对纳米免疫团簇NCPC抗膀胱癌作用机制进行进一步探讨。通过JC-1探针评估NCPC对膀胱癌细胞线粒体膜电位的影响。通过Westing Bloting评估NCPC作用5637膀胱癌细胞后capase 3表达情况。6.体内实验中:通过活体成像仪和荧光显微镜评估了NCPC在荷瘤BLAB/c裸鼠内的分布;构建正常免疫C3H/He N小鼠皮下膀胱癌模型,评估纳米免疫团簇NCPC的体内抑瘤作用;通过流式细胞术及流式荧光微球技术分别对治疗后小鼠肿瘤内免疫细胞分布、肿瘤和血清内细胞因子水平进行检测,评估NCPC对肿瘤微环境中免疫细胞和体内细胞因子的影响。7.通过检测小鼠体重变化、检测治疗后小鼠血常规和肝肾功能、观察主要脏器的细胞形态结构,初步评价纳米免疫团簇的安全性。【研究结果】1.相较于SV-HUC-1细胞,5637、HT-1376、T24膀胱癌细胞表面的CD47和PD-L1的表达水平普遍更高。MBT2膀胱癌细胞在肿瘤微环境中的CD47和PD-L1表达水平增加。最终选择人5637膀胱癌细胞株、小鼠MBT2膀胱癌细胞株和C3H/He N小鼠作为后续实验对象。2.SDS-PAGE提示纳米免疫团簇NCPC的分子量相较于游离抗体显著增大。Zeta电位测定提示正性电位PEI与负性电位抗体连接后电位趋近于零。动态激光散射仪提示NCPC平均粒径约为133 nm。原子力显微镜提示其3D形貌成网状。CCK-8实验提示在本研究作用浓度下,载体及其中间产物的生物相容性好。3.流式细胞术提示纳米免疫团簇NCPC具有很好的抗原识别和结合能力,相对于游离抗体,其与抗原的解离速率更慢。纳米免疫团簇NCPC可通过诱导凋亡、促巨噬细胞吞噬、激活TIL活性杀伤膀胱癌细胞。4.高通量测序结果表明,纳米免疫团簇NCPC导致的差异基因显著多于CPB,提示NCPC对膀胱癌有区别于游离抗体的独特作用机制。对差异表达基因的进一步GO和KEGG富集分析提示,NCPC可能是通过与细胞膜结合,导致细胞形态结构发生变化,激活下游信号通路(包括MAPK和IL-17通路),进而影响细胞的发育和凋亡。5.原子力显微镜检测结果提示纳米免疫团簇NCPC呈网状作用于5637膀胱癌细胞膜上,可使细胞形态变圆、细胞膜弹性模量变大。另外,NCPC可导致5637膀胱癌细胞线粒体膜电位去极化,导致caspase 3表达增加,触发细胞凋亡。6.体内实验表明,纳米免疫团簇NCPC相较于游离抗体具有更好的瘤内富集能力。NCPC相对于游离抗体及其联用,均可显著降低小鼠膀胱癌负荷。肿瘤浸润免疫细胞和细胞因子检测提示纳米免疫团簇NCPC可提高肿瘤微环境中M1型巨噬细胞、NKT细胞、Tc细胞等免疫效应细胞的占比,促进机体TNF-α、IFN-γ等抗肿瘤细胞因子的分泌。7.经纳米免疫团簇NCPC治疗后,小鼠体重、血常规、肝肾功能和主要脏器细胞形态结构与对照组均无明显差异,提示其具有较好的安全性。【研究结论】本研究成功构建一种抗CD47和PD-L1的双靶向纳米免疫团簇NCPC,它可同时阻断两种先天性免疫和适应性免疫检查点,并通过促巨噬细胞吞噬、TIL激活和诱导凋亡以杀伤膀胱癌细胞。NCPC在体内外实验中均体现出良好的抗膀胱癌作用,且安全性较好。本研究为膀胱癌联合免疫治疗提供了新的思路和选择。