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第1章引言假设Notch1作为内源性心肌保护因子,通过与PI3K/Akt、JAK/Stat3相互整合,发挥心肌保护作用。因此,本研究将围绕Notch1信号,以PI3K/Akt、JAK/Stat3信号通路为立足点,采用慢病毒载体构建及其感染技术,制备相应转基因心肌细胞与整体大鼠,在确认已产生缺血预适应(IPC)、缺血后适应(IPost)保护作用的基础上,从细胞活力、细胞凋亡等角度观察Notchl对心肌细胞的保护效应；在测定线粒体膜电位(△Ψm)、活性氧(ROS)的同时,比较细胞质与线粒体cytC的含量变化,检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达改变,以阐述Notch信号通路抑制心肌凋亡的分子机理；研究不同Notchl表达水平对心肌细胞Akt、 Stat3活性的影响,以探讨Notchl与PI3K/Akt、JAK/Stat3信号通路的交叉整合机制；最后在大鼠离体心脏灌注模型上,对Notch1信号的心肌保护作用进行进一步的比较论证,努力阐明Notch信号通路心肌保护效应的分子机制,为缺血性心脏病的临床治疗提供理论依据。第2章大鼠N1ICD慢病毒表达及干扰载体构建目的：构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-shRNA),为探讨Notchl信号通路对缺血心肌的保护奠定研究基础。方法：以大鼠cDNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建pGC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒；设计4对NlICD-shRNA寡核苷酸序列,以构建GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒,将pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA共转293T细胞,检测Flag的表达,筛选理想的GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒。将pGC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-shRNA与pHelper1.0、 pHelper2.0共转293T细胞,以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA,分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。结果：pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功,与pHelper1.0、pHelper2.0共转293T细胞后,取上清浓缩,分别获得滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA.结论：LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA包装成功,具有Notch1信号通路生物学功能。第3章Notch1激活PI3K/Akt、JAK/Stat3信号通路,发挥内源性心肌保护作用目的：明确Notch1可减轻心肌缺血再灌注损伤(IRI),探讨Notch1内源性心肌保护作用的分子机制。方法：建立H9c2心肌细胞缺氧、缺氧／复氧(H/R)、IPC、IPost模型,Western-blotting检钡NIICD/Hesl蛋白表达。LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA分别感染H9c2心肌细胞,建立体外心肌H/R、IPC及IPost模型后,CCK-8检测细胞活力；流式细胞仪分别检测细胞凋亡、△ψm、ROS;分离心肌细胞线粒体,检测cytC在细胞质和线粒体的表达；提总蛋白,Western-blotting检测Bax、Bc1-x1、 PTEN、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β,p-Stat3/Stat3蛋白表达。结果：Notch1信号通路在心肌缺血性损伤时处于激活状态。Notch1信号激活后,可提高缺血后心肌细胞活力,抑制细胞凋亡,稳定ΔΨm,减少ROS形成；同时还可减少线粒体cytC向细胞质的释放,下调PTEN、Bax的表达,上调Bcl-xl、 p-Akt、p-GSK-3β、p-Stat3表达。Notch1抑制后,Akt、Stat3活性减弱,IPC、 IPost失去心肌保护作用。结论：Notch1作为内源性心肌保护因子,通过激活PI3K/Akt、JAK/Stat3信号通路,调节心肌凋亡相关蛋白表达,抑制线粒体通透性转换孔开放,从而减轻心肌IRI。第4章Notch1信号改善心肌缺血后的心功能目的：探讨Notch1信号对心肌缺血后心功能的改善作用。方法：LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA分别感染Sprague Dawley大鼠,3w后建立Langendorff离体心脏灌注心肌缺血再灌注(I/R)、IPC、IPost模型,通过PowerLab系统实时观察各时期血流动力学参数变化。于缺血前、再灌注前、再灌注后检测乳酸脱氢酶(LDH),最后利用TTC染色测定心肌梗死面积(IS)。结果：Langendorff离体心脏灌注I/R、IPC、IPost模型构建成功。心肌I/R后Notch1信号的激活,可改善心肌缺血后血流动力学参数,降低LDH的释放,缩小IS,与心肌IPC、IPost相比,其对缺血后心功能的改善无显著差异。结论：Notch1信号可改善心肌缺血后的心功能。