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第一部分树突细胞核蛋白-1对褪黑素调控机制的研究目的:树突细胞核蛋白-1(DCNP1)是近期研究发现的一种定位于树突状细胞核内的蛋白,主要表达于人类的脑和骨骼肌之中。其具体功能尚不明确。本研究的目的在于阐明DCNP1参与调控褪黑素生物合成的新机制。方法:我们在大鼠胶质瘤细胞系C6细胞中过表达EGFP-DCNP1及其两种突变体EGFP-DCNP11-116、EGFP-DCNP1ΔRRK,通过ELISA实验检测褪黑素释放水平。再用Q-PCR、western blot检测褪黑素合成过程中的关键酶NAT的mRNA及蛋白水平。在HEK293细胞中过表达DCNP1及其突变体,通过染色质免疫沉淀实验观察DCNP1及其突变体与N-乙酰转移酶(NAT)启动子的结合情况。在HEK293细胞中过表达DCNPI及其突变体,通过免疫共沉淀实验观察DCNPI和NAT的一种转录因子BMAL1的结合情况。并通过免疫荧光实验观察DCNP1及其突变体与BMAL1的细胞定位情况。在在HEK293细胞中过表达DCNP1、NAT报告基因或者删除E-box的NAT报告基因,观察DCNP1对报告基因活性的影响。在HEK293细胞中敲减BMAL1之后再过表达DCNP1及其突变体和NAT报告基因,观察对照组与敲减组中DCNP1对NAT报告基因活性的影响。结果:ELISA实验表明而过表达全长型DCNP1可引起引起褪黑素分泌下调,而过表达DCNP11-116和DCNP1ΔRRK则没有上述作用。褪黑素合成过程中的关键酶NAT的mRNA及蛋白水平在过表达DCNP1的C6细胞中显著下降,但过表达DCNP11-116和DCNP1ΔRRK则没有影响。染色质免疫沉淀实验证明全长型DCNP1可结合NAT启动子,而DCNP1两种突变体则不能结合NAT启动子。免疫共沉淀实验证明全长型DCNP1可与BMAL1结合,DCNP1两种突变体不能与BMAL1结合。免疫荧光实验表明DCNP1与BMAL1在细胞核存在共定位。通过报告基因证实了全长型DCNP1抑制了 NAT报告基因的活性,并且对于删除E-box区域的NAT报告基因没有明显抑制作用。同时,在BMAL1敲减的细胞中,DCNP1对NAT启动子已经没有明显的抑制作用。结论:全长型DCNP1通过与BMAL1结合并抑制BMAL1对NAT的转录调控作用,从而抑制褪黑素的生物合成。第二部分树突细胞核蛋白-1对神经炎症调控机制的研究目的:观察树突状细胞核蛋白DCNP1对LPS诱导的神经炎症的调控作用,并进一步研究其作用机制。方法:在小鼠小胶质瘤细胞系BV2细胞中构建阴性对照以及FIAG-DCNP1稳转细胞系,使用脂多糖(LPS)100ng/ml预处理两组细胞系0h,4h,8h或者16h,用免疫印迹方法检测细胞中炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达。将稳转细胞系用LPS预处理16 h,用ELISA方法检测细胞培养基中的炎症因子TNF-α和IL-6的分泌量。将稳转细胞系用LPS预处理6h,使用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测炎症因子IL-6,TNF-α和炎症相关蛋白iNOS和COX2的mRNA水平。将对照组和过表达FLAG-DCNP1组BV2细胞系用LPS分别处理0 min,15 min,30 min,1 h后进行核质分离实验,用western blot检测p65在细胞质和细胞核中的含量。通过报告基因实验检测EGFP-DCNP1对NF-κB报告基因活性的影响。在HEK293中过表达EGFP-DCNP1或EGFP后进行免疫共沉淀实验,观察EGFP-DCNP1与p65的结合情况。结果:FLAG-DCNP1稳转BV2细胞在不同时间LPS刺激后,iNOS和COX2的表达量均明显低于对照组。ELISA实验显示,与对照组相比,过表达FLAG-DCNP1组中LPS诱导的细胞培养基中分泌IL-6的量明显更低,而TNF-α没有明显差异。与对照组相比,过表达FLAG-DCNP1组中LPS诱导的IL-6、TNF-α、iNOS和COX2的mRNA水平更低。核质分离实验中,对照组与过表达DCNP1组p65进核情况没有明显差异。而报告基因实验中过表达DCNP1可以明显抑制NF-κB报告基因活性。免疫共沉淀实验显示DCNP1和p65存在结合。结论:过表达DCNP1可以显著抑制LPS诱导的神经炎症反应,其作用机制可能与p65结合抑制NF-κB转录活性相关。