陆生植物气生器官的表面覆盖着一层由蜡质和角质形成的脂膜，蜡质主要由长链疏水物质组成，这些物质来源于含十六个碳或十八个碳的长链脂肪酸延伸复合物。蜡质在植物的表皮上结晶形成表皮蜡质，内部的蜡质与角质等以聚合体形式存在，表皮蜡质的功能包括调节表皮的渗透性、限制非气孔性失水、防止紫外线的照射、抵抗细菌、真菌病原菌的入侵、阻止生殖后器官融合及花粉和雌蕊的相互作用等。角质是构成表皮细胞壁外保护层的主要的物质。 对拟南芥进行大规模功能基因组学研究的过程中，分离到一个具有AP2结构域的乙烯应答型转录因子(ERF)—把这个转录因子称为WIN1(WAX INDUCER1)/SHN1(Atlg15360)。在拟南芥中过量表达WINI可提高参与蜡质合成途径中的基因的表达水平，从而显著提高转基因植物蜡质的积累，引起营养器官和生殖器官中角质合成增加和成分改变，增强干旱耐性及表皮渗透性。反之，下调这个基因则能引起相反的结果。其同源基因SHN2及SHN3与WIN1的功能相似。 新的耐盐模式植物盐芥与拟南芥近缘，在遗传特征和生活习性上与拟南芥相似，如：小的基因组，短的生活史，都是自花授粉，有丰富的种子等：在cDNA水平上与拟南芥有大约90—95％的同源性。同时，相比拟南芥，盐芥又有很多自身的优势特点，如有更强的耐受性和更为丰富的表皮蜡质等。因此，盐芥是一种很有前景的植物蜡质研究材料。用基因组学方法研究盐芥，可以鉴定和克隆在拟南芥中无明显性状的有价值的基因，特别是与植物表皮蜡质合成有关的基因。 为了能更深一步的研究WIN1基因的作用机理，我们以盐生植物盐芥为材料，从中克隆了其同源基因，分析了此基因的组织表达特异性，并构建了基因沉默及过量表达载体，以分析此基因在盐芥蜡质及角质代谢中的作用及与耐逆性的关系，主要工作总结如下： 1.盐芥WINl cDNA的克隆及序列分析 根据GeneBank中已知的WIN1类蛋白的cDNA和蛋白序列寻找保守区并合成简并引物，提取盐芥花的mRNA并反转录成cDNA，以此作为模板进行PCR扩增，得到一条中间片段，经过测序并进行Blast分析，该片段与拟南芥WIN1的同源性较高。根据已有中间片段设计特异引物利用5’—RACE和3’—RACE分别合成其5’、3’端序列，最终得到WIN1同源基因—ThWIN1。ThWIN1的cDNA序列全长846 bp，包括73 bp的5’—非编码区和194bp的3’—非编码区。开放阅读框为579 bp，编码192个氨基酸残基，Blastx分析显示ThWIN1氨基酸序列与拟南芥WIN1蛋白具有84％的同源性。 2.ThWIN1的RT—PCR表达分析 提取盐芥幼苗、叶、根、茎、花、角果总RNA，以内源Actin为内标，设计特异引物通过半定量RT—PCR，研究了ThWIN1在盐芥中的组织特异性表达。结果显示ThWIN1在花中表达量最高，在茎和角果中也有表达，在叶、幼苗、根中不表达或者表达量很低而没有检测到。 3.ThWIN1沉默载体的构建 将ThWIN1基因的特异区段114 bp测序正确后酶切连入pRT101i中间载体，用EcoR I和BamH I双酶切重组质粒pRT101i—ThWIN1，回收目的片段，连入同样双酶切的经过改造的pCAMBIA—3301H载体(含有CaMV35S启动子)，得到ThWIN1沉默表达载体pCAMBIA—3301H—Th WIN1。将沉默表达载体导入农杆菌GV3101，PCR鉴定挑选阳性克隆；花序浸染法进行盐芥的基因转化，收获了大量的种子；以除草剂Basta进行其转化子的筛选，获得了14株ThWIN1基因沉默构建的盐芥转化子。目前已得到T1代种子。 4.ThWIN1过量表达载体的构建 特异引物PCR多次测序正确后，将ThWIN1的开放读码框用BamHI和PmlI酶切后连入同样双酶切的植物表达载体pCAMBIA—3301H中，构建成除草剂(Basta)作为筛选标记的植物过量表达载体pCAMBIA—3301H—ThWIN1。将过量表达载体导入农杆菌GV3101，PCR鉴定挑选阳性克隆；花序浸染法进行盐芥的基因转化，目前已获得T0代种子。 5.利用酵母双杂交系统研究与ThWIN1转录因子相互作用的蛋白 大量法高质量提取盐芥花总RNA，纯化mRNA，构建盐芥cDNA文库，以ThWIN1为诱饵蛋白，利用酵母双杂交体系研究与ThWIN1转录因子相互作用的蛋白。目前已纯化了高质量的mRNA，后续工作正在进行。 本论文主要创新点： 1、首次从盐芥中克隆了ThWINI基因，并对核苷酸、氨基酸序列进行了分析。 2、首次在盐芥中分析了Th WIN1的组织特异性表达。 3、首次在盐芥中构建了ThWIN1的沉默载体和过量表达载体。 4、构建盐芥cDNA文库，利用酵母双杂交体系研究与ThWINI转录因子相互作用的蛋白。