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苯乙醇胺A(PhenylethanolamineA,PA)是一种新型的β-受体激动剂(β-Agonist)类药物,曾被作为生长促进剂应用畜牧生产中,以提高饲料利用率和家蓄胴体的瘦肉率。但PA有很明显的毒副作用,被人体食入后会引起恶心、心悸、呕吐等中毒症状。我国农业部已明文禁止(1519号)在动物饲料和饮水中添加PA。目前建立PA的检测方法主要包括液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法等。但是这些方法都存在需要昂贵的实验仪器、对样品需要进行前处理、检测时间长、不能进行大批量的检测等缺点。因此,建立一种针对PA快速、简便、灵敏的检测方法具有重要的现实意义。本试验在合成PA人工抗原的基础上,利用单克隆抗体技术和酶联免疫吸附技术,建立了检测PA在食品中残留的ELISA检测方法。该方法具有操作简单,灵敏度高、特异性强等特点,适合大批量样品的快速检测。1、PA人工抗原的合成和鉴定PA分子量小,不具有完全抗原性。试验根据PA分子的结构式,利用还原反应对PA的化学基团进行改造,获得了带有氨基的衍生物。再利用重氮化法将PA衍生物分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,获得完全抗原。完全抗原通过紫外扫描法、SDS-PAGE及免疫学等方法进行鉴定,判定PA与载体蛋白偶联成功。通过BCA法测得PA-BSA蛋白浓度为4.82 mg/mL,PA-OVA 蛋白浓度为 5.61mg/mL。2、PA单克隆抗体的制备以PA-BSA为免疫原,采用常规免疫程序免疫BALB/c小鼠,五免后测得血清效价在1:25600。利用杂交瘤技术将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合,再利用酶联免疫吸附技术对融合细胞进行筛选,获得了一株能稳定分泌抗PA单克隆抗体杂交瘤细胞株D6H8。采用体内诱生法制得13mL腹水,测得蛋白浓度为55.38mg/mL。腹水效价为1:12800。3、PA检测的ELISA方法建立利用方阵法确定包被原和腹水的最佳工作浓度为1:400和1:4000,建立检测PA的间接竞争ELISA方法(CiELISA)。PA浓度在5～1000ng/mL时,标准曲线线性关系良好,线性回归方程为 y=0.3861x-0.1845(R2=0.9902),IC50 为 58.88ng/mL,LOD 为 3.833ng/mL。交叉试验结果显示,制备的单克隆抗体对PA抑制率为100%,与沙丁醇胺、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素、盐酸去氧肾上腺素基本无交叉反应。4、猪肉中PA添加回收试验将猪肉样品进行前处理,当提取液作16倍稀释时,基本无基质干扰。建立CiELISA检测猪肉中PA的标准工作曲线,PA浓度在10～1000ng/mL范围内时,线性关系良好,线性回线性回归方程为 y=0.3785x-0.2588(R2=0.9898),IC50 为 93.97ng/mL,LOD 为 5.92ng/mL。用50、400、800ng/mL的PA标准溶液做回收试验,回收率在85.96%～104.32%之间。