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背景:IgA肾病(Immunoglobulin A Nephropathy,IgAN)是目前全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病,在我国尤为多见,是导致终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)常见原因之一。IgAN临床表现多样、病理改变复杂,其治疗方式目前仍存在争议。早期诊断及干预有助于改善预后,减少ESRD的发生。IgAN的发病机制尚不完全清楚,目前认为IgAN是一种自身免疫性疾病,最为公认的是多重打击机制。其中,由粘膜组织产生的B淋巴细胞所分泌的IgA1分子发生O-糖基化缺陷是IgAN致病的关键环节,表现为IgAN患者血清中半乳糖缺陷IgA1分子(Galactose Deficient IgA1,Gd-IgA1)表达水平较正常对照明显升高。循环IgA1来源于外周血B细胞,既往缺乏对IgAN患者外周血细胞进行分类深入研究。近年来,单细胞测序技术的发展解决了细胞异质性问题,可通过无监督聚类对细胞进行分群聚类和注释,有助于对特定细胞群的研究。因此,本研究采用单细胞转录组测序技术对IgAN患者和正常对照外周血单核细胞进行测序及数据分析,重点关注B淋巴细胞以探索IgAN的发病机制。方法:对3名IgAN患者和2名正常对照外周血进行单细胞转录组测序,建立IgAN外周血单细胞疾病差异基因表达谱,并进行功能分析等以探索IgAN的发病机制,同时采用RT-PCR对B淋巴细胞中的疾病差异基因进行临床样本验证以确保单细胞测序结果的可靠性。采用单核苷酸多态性研究分析、石蜡切片行免疫组化和多重免疫荧光染色共同探索肠道炎症相关的GWAS遗传位点与IgAN间的关系。采用RT-PCR对在IgAN外周血B淋巴细胞芯片检测中差异表达的EBVmiRNA-BART19-3p进行临床样本验证,通过ELISA检测血清Gd-IgA1的表达水平,同时对DAKIKI细胞转染EBV-miRNA-BART19-3p类似物探索其对IgA1 O-糖基化的作用情况。此外,检测血清中EBV抗体水平和血浆中EBV DNA表达水平以探索EBV感染对IgAN的致病机制。通过ELISA、石蜡切片行免疫组化和多重免疫荧光染色观察α1-抗胰蛋白酶在血清、尿液和肾组织中的表达水平。此外,LPS刺激DAKIKI细胞观察炎症刺激对SERPINA1的作用。结果:我们成功建立了IgAN外周血单细胞疾病差异基因表达谱,通过对IgAN患者和正常对照外周血B淋巴细胞进行mRNA表达量检测,SPI1、MXD1和S100A9的mRNA表达水平在IgAN患者中外周血B淋巴细胞高表达均得以验证,证明了单细胞测序结果可靠。功能分析发现在各细胞中差异基因广泛富集于炎症/感染相关的通路,其中包括EBV感染,通路互作分析显示EBV感染作用于抗原递呈通路。在B淋巴细胞非特异性炎症模型中,LPS刺激后,SPI1、MXD1和S100A9表达水平呈明显上升趋势。通过分析GWAS研究结果发现,CARD9、VAV3、PSMB8和PSMB9均为与肠道炎症相关的IgAN遗传易感基因,单核苷酸多态性研究分析结果显示CARD9rs4077515和VAV3 rs17019603的交互作用可增加IgAN的易感性,CT/TT和CC基因型患IgAN的风险是对照的2.56倍(OR=2.56,95%CI:0.98-6.69,P=0.049)。结合IgAN外周血单细胞转录组测序发现PSMB8和PSMB9表达水平升高,小鼠的肾脏单细胞测序和肾脏组织的免疫组化及荧光染色共同证明PSMB8和PMB9定位于第二类新型细胞。结合芯片分析,我们验证了EBV-miRNA-BART19-3p在IgAN患者B淋巴细胞中呈高表达(P=0.024),但其与Gd-IgA1水平和外周血B淋巴细胞中糖基化相关基因的表达水平无明显相关性。但EBV-miRNA-BART19-3p表达量的增高与下游基因MXD1表达变化相关。我们进一步检测IgAN患者和正常人血清中EBV抗体的表达水平发现,IgAN和正常人EBV既往感染率均达80%以上,且EBV感染情况在两组中无明显差异。EBV DNA在IgAN和正常对照血浆中阳性率低且两组间无差异。尿液糖蛋白质谱分析显示,IgAN患者α1-抗胰蛋白酶表达显著升高,同时其编码基因SERPINA1在IgAN外周血单细胞测序中明显上调。验证实验表明SERPINA1 mRNA水平在IgAN B淋巴细胞中较正常对照增高(8.75±6.23 vs.3.02±1.80,P=0.007)。此外,α1-抗胰蛋白酶在肾脏组织中也明显增高,主要表现在毛细血管袢和系膜区,但在血清中其含量并无明显升高。通过临床分析发现,尿液α1-抗胰蛋白酶与血清Gd-IgA1表达水平呈负相关,B淋巴细胞中SERPINA1 mRNA表达水平与血清C3、C4呈正相关,以上结果均证实呼吸道感染与IgAN有关。结论:成功建立了IgAN外周血单细胞疾病差异基因表达谱,结果证实炎症/感染通路与IgAN密切相关。从肠道感染、呼吸道感染和非特异性炎症三个方面进一步证明了炎症与IgAN相关。多角度证明α1-抗胰蛋白酶在IgAN中表达增高,其临床意义还待进一步研究。