日本沼虾(Macrobrachium nipponense),俗名青虾,是我国重要的淡水养殖是虾类,年产量超过25万吨,年产值超过百亿元。雄性日本沼虾的生长速度显著快于雌性日本沼虾,收获时雄虾规格为雌虾的2-2.5倍,因此全雄化养殖具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。动物性别的形成取决于两个过程,即性别决定和性别分化,了解性别决定和性别分化机制是实现其性别调控和全雄制种的基础。促雄腺(androgenic gland,AG)是甲壳类动物特有的内分泌腺,在甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持方面具有重要的作用。目前,已见日本沼虾等多种甲壳动物促雄腺成体组织学研究的报道。关于促雄腺相关基因的研究主要集中在胰岛素样促雄腺激素基因(insulin-like androgenic gland hormone, I AG)。有关促雄腺发育过程组织学研究、促雄腺表达的性别相关基因的系统筛选及其表达规律等研究至今未见报道。本研究拟以日本沼虾为研究对象,对变态后发育过程进行组织学观察和类固醇激素含量测定,以确定促雄腺及性腺分化的起始时间,发育过程及成熟时间;采用高通量测序技术,构建日本沼虾促雄腺转录组文库和microRNA (miRNA)文库,并在同源分析和表达量比较的基础上筛选性别相关基因和性别相关miRNA;结合组织学切片数据、基因时空表达规律和RNA干扰结果,对筛选得到的性别相关基因进行功能分析。1.日本沼虾变态后发育过程促雄腺及性腺发育组织学研究在30℃的养殖条件下,以日本沼虾全同胞家系为材料,采用组织学切片及类固醇激素测定等方法对发育过程进行研究。结果表明,促雄腺在变态后第10天(Post-larvae 10, PL10)开始分化,出现索状结构:随后经历增殖期(PLI0)、合成期(PL13)和分泌期(PL19)共3个发育阶段;最后在PL19发育成熟,形成完整的促雄腺结构。日本沼虾精巢和卵巢均在变态后第13天(PL13)开始发育。在PL13时,精原细胞开始形成,精原细胞呈不规则排列,而卵巢生殖上皮开始分化出呈椭圆或多边形的卵原细胞。精巢经历精原细胞期(PL13)、精母细胞期(PL16)、精细胞期(PL19)和精子期(PL22)共4个发育阶段后,在PL22发育成熟,此时成熟的精巢生精小管内充满着成熟的精子;卵巢经历卵原细胞期(PL13)、初级卵母细胞期(PL16)、次级卵母细胞期(PL16)和卵子期(PL19)共4个发育时期后,在PL19发育成熟,此时卵巢充满成熟的卵子。类固醇激素分泌量分析显示,睾酮分泌量从PL1到PL22逐渐增加,然后维持在稳定水平至PL25,随后逐渐下降;17β-雌二醇的分泌量从PL1到PL19逐渐增加,然后维持在稳定水平至PL25,随后逐渐下降。本研究显示促雄腺与精巢发育过程均持续10天,但促雄腺早于精巢3天开始发育和成熟,为性别和生殖相关基因的筛选以及发育过程性别调控机制的研究提供参照。2.日本沼虾促雄腺转录组文库的构建采用Illumina Hiseq2000测序平台构建日本沼虾促雄腺转录组文库。提取日本沼虾促雄腺总RNA用于构建促雄腺转录组,拼接后共产生78,408条转录本,核酸序列长度从351 bp到23,271 bp;过滤后共获得57,619个基因,平均核酸序列长度为1,244.19 bp。使用 Blastp 及 Blastx 在 NCBI 的 non-redundant (Nr)及 nucleotide sequence 数据库对拼接获得的基因进行功能注释,促雄腺转录组共有70,702条转录本在Nr数据库中找到了功能注释,7,706条转录本没有功能注释。促雄腺转录组文库中,分别有33,203、13,817、17,868个基因与GO、COG、KEGG数据库中的基因序列高度同源。根据日本沼虾促雄腺转录组中基因的功能注释,共筛选到47个与其它物种性别决定和性别分化基因高度同源的基因或基因家族,包括IAG、sx1、Tra-2等。通过将促雄腺转录组文库与日本沼虾输精管、精巢及卵巢转录组进行比较分析后,共筛选得到促雄腺高表达基因40个,为日本沼虾性别相关的候选基因,其中24个基因为促雄腺特异表达,剩余的16个基因与IAG基因具有相似的表达模式,其特点为在促雄腺中的表达量极高,但在输精管、精巢和卵巢中的表达量极低。与此同时,日本沼虾促雄腺转录组还筛选得到12,437个SSR标记及65,535个SNP标记。3.日本沼虾促雄腺microRNA文库的构建采用IlluminaHiseq2500测序平台构建了日本沼虾促雄腺miRNA文库。去除掉低质量的原始序列后,日本沼虾促雄腺miRNA文库测序共获得22,549,954条高质量的原始序列;其中,长度为18-32 nt的序列共有17,574,958个,绝大部分(43.96%)原始序列长度为20nt到23nt。通过在miRBase数据库中进行功能注释,日本沼虾促雄腺共得到1,077个miRNA,其中原始序列片段数超过60,000的miRNA包括miR-100,bantam,miR-184,miR-315,let-7,miR-315, miR-8-5p,miR-10,miR-8-3p 和 miR-12。使用 NCBI 中的 EST 数据库、SRA数据库以及RNA-Seq构建的日本沼虾促雄腺转录组为背景参考进行预测,分别得到8,248, 76,011和78,307个靶基因。根据靶基因的功能注释,筛选得到48个与日本沼虾性别相关的miRNA。4.日本沼虾性别相关基因的克隆、时空表达定量以及功能分析根据基因的功能注释,从日本沼虾促雄腺转录组中挑选出与鱼类及哺乳动物Fox12 (Forkhead boxL2)基因高度同源的序列进行克隆、qRT-PCR表达以及功能分析,以确定Foxl2在日本沼虾中的功能;根据基因在促雄腺中的表达量分析,从日本沼虾促雄腺转录组中挑选出促雄腺极高表达基因Slow-tonic S2 tropomyosin (Sst)和Slow tropomyosin isoform (Sti)进行克隆及qRT-PCR表达分析,以确定其是否为日本沼虾性别相关基因。4.1日本沼虾Fox12基因的克隆、表达分析及功能研究采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)进行克隆。日本沼虾Fox12基因cDNA序列全长为2,097 bp,包含1,740 bp的开放阅读框,其编码579个氨基酸序列(Accessionno. KM821275)。日本沼虾Foxl2基因与其他鱼类和两栖类动物报道的Fox12基因氨基酸序列一致性达到60%-75%,但其序列覆盖度仅为20%;日本沼虾Fox12基因的氨基酸序列长度显著长于其在鱼类及两栖类动物中的长度;Fox12基因包含一段高度保守的氨基酸序列,该序列位于日本沼虾Fox12基因245 aa到400 aa之间。日本沼虾Foxl2基因进化树分析结果显示,哺乳动物及鱼类为一支,日本沼虾为另一支。不同成体组织qRT-PCR分析结果显示,日本沼虾Foxl2基因在精巢和促雄腺中具有极高的表达量,而且在雄性心脏、肠、眼柄及鳃中的表达量显著高于雌性中相同组织的表达量,推测日本沼虾Fox12基因参与雄性性别的分化发育。日本沼虾Fox12基因在不同发育时期定量分析结果表明,Fox12基因在PL10出现表达高峰,与精巢开始分化时间基本吻合。上述结果表明Fox12基因可能参与日本沼虾雄性分化发育过程。采用RNAi技术对日本沼虾Fox12基因进行功能分析,注射dsRNA后精巢及卵巢Fox12基因的表达量显著下降,但性腺发育指数(Gonad somatic index, GSI)未观察到明显.变化,其它方面的影响有待进一步研究。4.2日本沼虾Sst和Sti基因的克隆及表达分析采用RACE和qRT-PCR技术对日本沼虾Sst和Sti基因进行克隆及表达分析。日本沼虾Sst和Sti基因的cDNA序列全长分别为977 bp (Accession no. KF910722)和1,926 bp (Accession no. KF910723) , 1 到 823bp 序列完全一致,差异出现在 824 bp以后的序列;Sst和Sti基因开放阅读框均为852bp,共编码283个氨基酸序列,开放阅读框的序列相似度为95.82%,氨基酸序列差异主要在C端的269 aa到283 aa,其结果与美洲龙虾报道的结果相似。进化树分析结果显示,这两个基因与其它物种slow型原肌球蛋白进化关系最近。不同成体组织qRT-PCR定量分析结果显示,Sst和Sti基因在促雄腺中的表达量最高,并显著高于其在其它组织的表达量,表明其可能在日本沼虾促雄腺中起重要作用。不同发育时期qRT-PCR定量分析结果显示,这两个基因在溞状幼体期和出膜后第10天(L10)表达量极高,推测其在发育过程中还承担了性别分化发育以外的其它功能。本研究首次确定了日本沼虾促雄腺及性腺分化的起始时间、发育过程及成熟时间,首次构建了日本沼虾促雄腺转录组和miRNA文库并系统地筛选促雄腺中性别相关功能基因和性别相关miRNAs,为日本沼虾性别决定和性别分化研究积累了科学数据,为进一步阐明日本沼虾乃至其它甲壳类动物性别决定机制奠定了基础。