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研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以认知和记忆功能进行性减退为临床表现的中枢神经系统(central nervous system, CNS)退行性疾病。随着人口老化,AD发病增多,发病机制未明,目前尚无有效的治疗方法,给家庭、社会带来沉重负担。因此,亟需研究寻找有效的治疗措施。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是主要的神经营养因子之一,对周围神经系统和中枢神经系统的多种递质神经元具有广谱作用,具有很强的刺激和促进神经细胞生长、分化及促使损伤细胞修复的作用。文献报道体对外培养的神经前体细胞给予BDNF可诱导促进其向神经元方向分化。但目前BDNF仍未能在神经系统疾病的临床治疗中应用,因为BDNF是天然的蛋白分子,难以通过血脑屏障(blood-brain barrier, BBB),如何把足量的BDNF传送到中枢神经系统损伤的适当部位仍存在困难,而且经常性的脑内注射给药,有导致颅内新的损害或感染的可能。很多研究表明外源性重组BDNF对不同脑损伤均有保护作用。因此,基因转染是目前能提供长期疗效的治疗方法,基因修饰的细胞脑内移植现已成为研究的重点。pEGFP-N1是一种常用的质粒载体,其荧光强度较GFP高出35倍。该质粒具有很强的复制能力,可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞;含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV,可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达;具有多克隆位点,便于目的基因的插入;该载体具有kan和neo基因,便于筛选含有该质粒的细菌或细胞。这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达,可以作为重组BDNF的表达载体。近年来,转基因治疗已越来越多得受到人们的关注,但基因治疗的载体问题,以及载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性问题是限制基因治疗发展和临床应用的瓶颈。基因载体必须具备安全、稳定、转染率高等特点。非病毒载体与病毒载体相比具有无免疫原性,无遗传毒性等优势。纳米载体由于其特有的优点如结构可设计性、粒径可控性、缓释性、具备较小粒径等,已越来越多地受到人们的研究和关注。研究表明,当纳米粒粒径小于100 nm时,其转染效率比大于100 nm的纳米粒高27倍。高分子聚合物聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[poly(D, L-lactide-co-glycolide), PLGA]是经美国FDA批准用于人体的生物可降解、生物相容的材料,广泛用于组织工程及药物载体研究中,具有支架和缓释的双重作用,有作为质粒DNA控释系统的潜在价值。然而PLGA的疏水性限制了它的优势。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是非离子型亲水片段,是最常用亲水性修饰分子,生物相容性优良,亲水性较强,细胞穿透性较高,体内无毒,无免疫原性,已被FDA批准用于人体。在疏水性PLGA分子中引入亲水性PEG链段可以改善聚合物的亲水性和柔顺性,增强粒子稳定性与抗酶活性,改良与细胞成分的相互作用。同时,PEG形成的亲水微环境,可提高DNA装载效率,有利于基因类药物活性保持。十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)属阳离子表面活性剂,有良好的稳定性及生物降解性。利用CTAB修饰MePEG-PLGA纳米粒,可以使纳米粒表面带上正电荷,以便高效结合带负电荷的DNA。本研究选用纳米粒沉淀法制备阳离子载基因MePEG-PLGA纳米粒,这一方法不需要借助超声、高速剪切等外力,也不会引入高温、有毒有机溶剂等因素,有利于保持生物敏感大分子的生物活性。通过单因素考察的正交设计实验,筛选出最优的制备方案,得到纳米粒平均粒径大小适中,表面电位较高的纳米粒子。并对纳米粒的平均粒径分布,表面形态,载药量,保护质粒DNA能力进行考察。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从大鼠海马组织总RNA扩增BDNF基因,构建含BDNF基因的重组表达载体,筛选签定得到正确的重组表达载体,为下一步转染作准备。结论:1单因素分析显示纳米粒平均粒径随MePEG-PLGA用量滴加速度的增加而增加;随磁力搅拌速度和丙酮体积的增加而降低;在一定范围内增加CTAB的浓度,纳米粒平均粒径降低,但达到一定浓度时,平均粒径逐渐增大。2正交设计实验及其结果的方差分析显示,MePEG-PLGA用量和磁力搅拌速度对平均粒径有显著影响;有机溶剂滴加速度对平均粒径的影响不显著。结合单因素考察的结果,选定最优处方为:MePEG-PLGA,50 mg;CTAB浓度,0.5%;滴加速度,2.5 mL/min;磁力搅拌速度,300 rpm;丙酮体积,5 mL。3以最优处方制备纳米粒,平均粒径为89.7 nm,表面电位为28.3 mV,透射电镜下的纳米粒颗粒分散,大小均匀,表面光滑,呈球形分布,DNA结合率为80%,并能很好地保护所载基因不受核酸酶降解。4采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从大鼠海马组织总RNA中成功扩增了BDNF基因,通过酶切连接反应构建pEGFP-BDNF重组表达载体,经筛选签定得到了正确的重组表达载体,