绵羊支原体肺炎是一种能引发绵羊以咳嗽、喘气、渐进性消瘦及肺间质的增生性炎症为特征的慢性呼吸道疾病,对养羊业危害严重。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)是一种在呼吸道上皮高表达的蛋白质分子,参与了宿主防御活动,具有抗菌和抗炎的功能,同时还能抑制肺炎支原体生长。目的:本研究通过克隆巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因c DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,通过真核表达巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因,研究重组SPLUNC1蛋白对绵羊肺炎支原体的作用,验证其生物活性,为下一步研究绵羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。方法:(1)巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因全长c DNA的扩增:根据Gen Bank上已报道的牛的SPLUNC1基因序列,设计引物,使用RACE技术分别克隆巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的3’端序列和5’端序列,并测序、拼接获得巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的全长c DNA序列。(2)巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因全长c DNA的生物信息学分析:利用生物信息学软件及在线分析工具对获得的巴什拜羊与湖羊SPLUNC1基因全长c DNA序列进行核酸及其编码蛋白信号肽、亚细胞定位、二级结构、三级结构、进化树等生物信息学分析。(3)巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的克隆与表达:使用PCR方法扩增出巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的开放阅读框序列,并将该序列连接至p PIC9K真核表达载体,构建p PIC9K-SPLUNC1表达质粒,转化至巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中进行诱导表达,优化诱导表达条件并对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定。(4)重组巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1蛋白的纯化与生物活性研究:利用Ni柱纯化方法分别对重组巴什拜羊与湖羊SPLUNC1蛋白进行纯化,将纯化的蛋白作用于绵羊肺炎支原体,使用荧光实时定量法检测纯化蛋白对绵羊肺炎支原体的作用。结果与结论:(1)巴什拜羊、湖羊SPLUNC1基因全长分别为1095bp和1091bp,核苷酸相似性为99%。(2)巴什拜羊、湖羊SPLUNC1的核苷酸序列有五处核苷酸碱基差异,但是二者的开放阅读框均为768bp,编码氨基酸相同,均为255个氨基酸。SPLUNC1蛋白质的分子量为26.53 KD,理论等电点为5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信号肽,亚细胞定位在细胞外。SPLUNC1蛋白质的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲。该蛋白由4股反平行的肽段形成的β折叠片和2个α螺旋组成的桶型结构域组成。系统发育树分析结果说明,SPLUNC1蛋白与山羊首先聚为一类,后与牛聚为一类,这与动物学分类结果一致。(3)在巴斯德毕赤酵母GS115中成功表达巴什拜羊与湖羊重组SPLUNC1蛋白,经SDS-PAGE检测发现,蛋白的分子量均为25.53k D,且在甲醇诱导72h表达的蛋白含量较高,经Western Blotting检测证实表达蛋白为目的蛋白。(4)SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白,结果显示为单一的条带,且分子量为25.53k D,说明成功纯化了目的蛋白。实时荧光定量PCR结果表明,巴什拜羊和湖羊的重组SPLUNC1蛋白对支原体生长具有明显的抑制作用,说明表达的巴什拜羊和湖羊的SPLUNC1蛋白具有良好的生物学活性。