肺癌作为威胁人类健康和生命的恶性肿瘤,每年世界范围内上百万人死于肺癌,肺癌已成为所有恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤,其病死率和死亡率增长迅速,而我国肺癌发生率和死亡率居于世界首位,同时肺癌的发生呈现年轻化的趋势,近20年来我国肺癌呈现年轻化、发病率及死亡率“三线”走高的趋势。c-Met (cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,间质表皮转化因子)基因属于原癌基因,编码肝细胞生长因子的跨膜受体,c-Met且有酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TKs)活性,c-Met酪氨酸激酶是唯一已知的肝细胞生长因子高亲和性受体,被活化后的c-Met与肝细胞生长因子(HGF)结合,可以调节机体各种组织和细胞的增殖、分化和侵袭活动。一旦构成HGF/c-Met信号通路异常活化,将促进多种肿瘤的发生和发展以及转移。研究发现c-Met介导异常信号转导通过c-Met过表达、c-Met基因扩增和c-Met基因突变等调控多种肿瘤包括肺癌的发生和发展。c-Met在多数肺癌组织中呈高表达。其中非小细胞肺癌中不同类型c-Met表达由高到低依次为腺癌、大细胞癌、鳞癌。c-Met基因扩增在肺癌耐药机制的研究中具有重要意义,可以应用c-Met为治疗靶点进行肺癌的治疗,然而,判定c-Met在肺癌组织中的表达状态只能依靠活检或手术取材肺癌组织,为了进一步探求灵敏、可靠的c-Met在肺癌组织中的表达状态的生物标记物我们有必要找到相关证据。可溶性c-Met(Soluble Met, s-Met)是c-Met脱落的胞外域,在部分肿瘤的细胞培养上清中表达,但s-Met是否可作为评估肺癌中c-Met的表达状态的标记物尚未有研究。因此本部分对s-Met与c-Met在肺癌中的表达状态的相关性研究；并体外培养对EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌细胞,通过siRNA c-Met转染并联合EGFR-TKI药物厄洛替尼(elortinib)等联合应用,研究以c-Met为靶点联合EGFR-TKI药物治疗EGFR-TKI获得性耐药的非小细胞肺癌的作用。第一部分 可溶性c-Met作为检测肺癌组织c-Met表达敏感、可靠标记物的研究目的：探讨s-Met作为检测肺癌组织c-Met表达敏感、可靠标记物的研究方法：选取2013年1月至2013年12月期间146例经病理组织学检查确诊为肺癌的入住我院胸外科治疗的患者的临床资料和组织标本、治疗前及手术前后血液样本,同时收集40例健康志愿者血样。ELISA法检测：s-Met的表达,免疫组化检测肺癌组织中c-Met的表达,并分析二者相关性。结果：①在健康志愿者和肺癌患者血清中都有s-Met的表达,健康志愿者外周血清中s-Met浓度范围为178.5-963.0ng/mL,平均浓度(672±47.6)ng/mL；肺癌患者外周血清中浓度范围为78.9-1781.2 ng/mL,平均浓度(1146±93.6) ng/mL,肺癌患者明显高于正常志愿者,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。②肺癌患者血清中s-Met浓度与肺癌组织中c-Met表达呈良好的相关性。肺癌组织中过表达c-Met (IHC 2+/3+)的患者血清中s-Met浓度显著增高,与正常对照组或c-Met表达阴性的肺癌患者血清中s-Met表达比较,具有显著统计学差异(P<0.05)；然而,在肺癌组织中c-Met表达弱阳性(IHC 1+)或阴性的患者中血清中s-Met浓度并不显著增高,与正常对照组或c-Met表达阴性患者比较,不具有显著统计学意义(P>0.05)。进一步利用H评分方法分析肺癌患者血清中s-Met浓度和肺癌组织c-Met表达相关性评估的正确性进行确认,结果可见,所有肺癌组织中c-Met表达阳性患者的H评分和血清中s-Met浓度呈线性正相关(R2=0.804),进一步提示了血清中s-Met浓度和肺癌组织中c-Met表达水平具有良好的相关性。③s-Met表达变化随着不同临床分型的肺癌而表达不同。与正常健康对照组比较,高分化肺癌患者的s-Met的表达增加,与正常健康对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而随着分化程度的降低,s-Met的表达进一步增加,与低度恶性肺癌组织比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；在TNM分期中,s-Met的表达随着TNM分期级别增高而进一步增加,与正常健康对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。s-Met的表达与肺癌分化程度呈负相关关系,和肺癌分期呈正相关,此结果与c-Met表达状态与肺癌临床资料之间的关系一致。④c-Met过表达的肺癌患者手术切除后检测血清中s-Met浓度,结果显示血清中s-Met的浓度较术前水平显著降低,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。而在c-Met表达阴性的肺癌患者手术切除后检测血清中s-Met的浓度,血清中s-Met表达水平较术前未见明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。在c-Met表达弱阳性的肺癌患者手术切除后检测血清中s-Met的表达,结果血清中s-Met表达水平也略降低,与术前水平比较差异不具有统计学意义(P<0.05)。⑤血清中s-Met寸评估肺癌组织中c-Met表达状态的性能进行判定,结果显示临界值敏感性(真阳性／(真阳性+假阴性))达89.2%,而临界值特异性(真阴性／(真阴性+假阳性))达94.6%,此结果说明血清中s-Met水平可以作为评估肺癌肿瘤组织中c-Me表达状态可靠且敏感的预测分子。⑥无论是在肺癌患者肿瘤组织中c-Met表达阴性,或肺癌患者肿瘤组织中c-Met过表达的情况下, s-Met都和肿瘤大小无关,相关性分析结果显示肺癌患者肿瘤组织c-Met表达阴性的患者的R2=0.057,c-Met过表达患者R2=0.075。小结：肺癌患者血清中s-Met浓度和肺癌组织中c-Met表达水平具有良好的相关性。s-Met的表达与肺癌分化程度呈负相关关系,和肺癌分期呈正相关关系。在肺癌中增高的s-Met是由过表达c-Met的肺癌组织分泌进入血循环中。血清中s-Met浓度的检测可以作为肺癌组织中c-Met表达判定的指标。第二部分c-Met mRNA及蛋白、可溶性c-Met在EGFR-TKI耐药细胞系中的表达研究目的：对c-Met mRNA及蛋白、s-Met在EGFR-TKI耐药细胞系中的表达进行研究。方法：体外培养并建立对EGFR-TKI厄洛替尼耐药的肺癌细胞系A549,siRNA c-Met转染入耐药细胞系,利用Real time PCR检测c-Met mRNA表达,利用Western blot检测c-Met蛋白表达,ELISA法检测细胞上清中s-Met的表达。并对EGFR-TKI耐药A549细胞上清s-Met表达和细胞c-Met蛋白表达的相关性进行分析。结果：①EGFR-TKI耐药A549细胞系中c-Met mRNA表达显著增加,与正常A549细胞系中c-Met mRNA表达比较,具有显著统计学差异(P<0.05)。当siRNAc-Met转染入耐药A549细胞系后,可显著减少c-Met mRNA在EGFR-TKI耐药A549细胞系中的表达,与耐药A549细胞系比较,差异有统计学意义(P<0.05),而与正常A549细胞系中c-Met mRNA表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②EGFR-TKI耐药A549细胞系中c-Met蛋白表达显著增加,与正常A549细胞系中c-Met蛋白表达比较,具有显著统计学差异(P<0.05)。当siRNA干扰c-Met并转染入耐药A549细胞系中,可显著减少c-Met蛋白在EGFR-TKI耐药A549细胞系中的表达,与耐药A549细胞系比较,具有显著统计学差异(P<0.05),而与正常A549细胞系中c-Met蛋白表达比较,无统计学差异(P>0.05)。③EGFR-TKI耐药A549细胞上清中的s-Met表达显著增高,与正常A549细胞上清中s-Met表达比较,具有显著统计学差异(P<0.05)。当siRNA干扰c-Met并转染入耐药A549细胞系中,可显著减少s-Met在EGFR-TKI耐药A549细胞上清中的表达,与耐药A549细胞系比较,具有显著统计学差异(P<0.05),而与正常A549细胞系上清中s-Met表达比较,不具有统计学差异(P>0.05)。EGFR-TKI耐药A549细胞上清s-Met表达和细胞c-Met蛋白表达存在正相关性,有统计学意义(P<0.05)。通过可溶性c-Met表达和细胞c-Met蛋白表达比较分析,证实在厄洛替尼耐药细胞系中c-Met蛋白表达增加,可同时使s-Met表达增加,而siRNA干扰c-Met可抑制c-Met mRNA表达和蛋白表达,同时抑制s-Met表达。统计分析证实,EGFR-TKI耐药A549细胞上清s-Met表达和细胞c-Met蛋白表达存在正相关性,具有统计学意义(r2=0.613,P<0.05)。小结：本部分研究从细胞水平研究证实EGFR-TKI耐药细胞系中c-Met mRNA和蛋白表达显著增加,s-Met在EGFR-TKI耐药细胞上清中的表达和c-Met蛋白表达存在正相关,可提示肿瘤细胞对EGFR-TKI敏感性改变情况。第三部分以c-Met为靶点提高EGFR-TKIs耐药NSCLC田胞敏感性的作用研究目的：探讨以c-Met为靶点联合EGFR-TKI治疗EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC的作用。方法：体外培养并建立对EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞系；将耐药细胞随机分为4组：对照组：培养的耐药A549细胞；厄洛替尼组：利用厄洛替尼加入耐药A549细胞,siRNA c-Met组：单独siRNA c-Met转染入耐药A549细胞,联合作用组：将厄洛替尼作用于siRNA c-Met转染入耐药A549细胞。检测各组细胞增殖、克隆形成以及侵袭情况的差异。MTT检测各组细胞增殖情况；细胞克隆形成检测各组细胞克隆形成情况；Transwell小室检测各组细胞侵袭能力改变情况。结果：①在单独加入厄洛替尼作用于EGFR-TKI耐药A549细胞中,不影响肿瘤细胞增殖,与厄洛替尼耐药A549细胞增殖比较,不具有统计学意义(P>0.05)。当利用siRNA c-Met转染后,可明显抑制肿瘤细胞增殖,与厄洛替尼耐药A549细胞和厄洛替尼作用组肿瘤细胞增殖比较,具有显著统计学意义(P<0.05)。将厄洛替尼作用于siRNA c-Met转染后耐药A549细胞,可看到肿瘤细胞增殖被更加明显的抑制,与EGFR-TKI耐药A549细胞和厄洛替尼作用组肿瘤细胞增殖比较,具有显著统计学意义(P<0.05),而和siRNA c-Met单独作用组比较,虽抑制作用更加明显,但不具有统计学意义(P>0.05)。②在单独加入厄洛替尼作用于建立的EGFR-TKI耐药A549细胞中,不影响肿瘤细胞克隆形成,与厄洛替尼耐药A549细胞克隆形成率比较,不具有统计学意义(P>0.05)。当利用siRNA c-Met转染后,可明显抑制肿瘤细胞克隆形成,与耐药A549细胞组和厄洛替尼作用组肿瘤细胞克隆形成比较,差异有统计学意义(P<0.05)。将厄洛替尼作用于siRNA c-Met转染耐药A549细胞,可看到肿瘤细胞克隆形成被更加明显的抑制,与EGFR-TKI耐药A549细胞和厄洛替尼作用组肿瘤细胞克隆形成比较,差异有统计学意义(P<0.05),而和siRNA c-Met单独作用组比较,虽抑制作用更加明显,但不具有统计学意义(P>0.05)。③在单独加入厄洛替尼作用于建立的EGFR-TKI耐药A549细胞中,不能影响肿瘤细胞侵袭能力。当利用siRNA c-Met转染后,可明显抑制肿瘤细胞侵袭能力；将厄洛替尼作用于siRNA c-Met转染入耐药A549细胞,可看到肿瘤细胞侵袭能力被更加明显的抑制,而和siRNA c-Met作用组比较,抑制作用也更加明显,但不具有统计学意义(P>0.05)。小结：本部分研究从细胞水平实验研究证实以c-Met为治疗靶点可以抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞增殖,克隆形成,以及侵袭能力,而抑制c-Met联合EGFR-TKI治疗可进一步抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞增殖,克隆形成,以及侵袭能力,说明以c-Met为治疗靶点可以改善肿瘤细胞耐药,增强肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性。结论：本课题通过从肺癌患者肿瘤组织和血样表达结果证实血清中s-Met浓度的检测可以作为肺癌组织中c-Met表达判定的指标。从细胞水平研究证实EGFR-TKI耐药细胞中c-Met mRNA和蛋白表达显著增加,以c-Met为治疗靶点可以抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞增殖.克隆形成.以及侵袭能力；s-Met生EGFR-TKI耐药肺癌细胞上清中的表达和c-Met蛋白表达存在正相关,可提示肿瘤细胞对EGFR-TKI敏感性改变情况。