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罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）是具有强大断肢再生能力的水生甲壳动物,其整个生命过程均具有断肢再生能力,再生新肢断肢后仍具再生能力,且再生肢体的结构和功能也很完善。尽管如此,其再生的分子信号转导机制研究几乎空白。为探究罗氏沼虾附肢再生的分子机制,本论文以罗氏沼虾为研究对象,从形态学及组织学分析其附肢再生过程,明确再生重要阶段,并对其中关键再生阶段进行比较转录组研究,分析罗氏沼虾附肢不同再生阶段的基因表达谱,从中候选参与再生的关键信号通路BMP信号通路,再深入研究BMP信号通路关键基因在附肢再生过程中的功能,以期探讨BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制,为甲壳动物的再生研究提供理论依据。具体研究内容及结果如下:1.罗氏沼虾附肢再生过程的形态学观察及组织学分析通过压力法迫使罗氏沼虾步足自切,观察其附肢再生完整过程,了解到新肢体再生所需时间约10天,此外明确了罗氏沼虾附肢再生的重要阶段,分别划分为伤口愈合期（24h）、芽基形成期（48h）、肢芽形成期（4d）、肢芽生长期（7d）以及新肢形成期（10d）。同时通过组织切片观察,发现罗氏沼虾附肢再生早期阶段的细胞组织形态变化明显。2.基于不同再生阶段转录组解析罗氏沼虾附肢再生分子机制基于罗氏沼虾附肢再生过程的形态学及组织学分析结果,选择罗氏沼虾再生0h（对照组）、6h（伤口愈合早期）、24h（伤口愈合期）和10d（新肢生长期）等4个时期的断肢基部肌肉组织进行高通量转录组测序。测序一共得到了91,044个unigene,平均长度为1,655bp,N50值为3,345bp。unigene功能注释结果显示,NR、Swiss-portdatabase、KOG和KEGG数据库中分别注释了37,056（40.7%）、28,723（31.54%）、16,616（18.25%）和20,078（22.05%）个unigene。此外,大量差异基因在不同再生阶段显著富集,同时在再生早期阶段多个转录因子包括Mr ELK4-like、MrELF124、MrPRDM79、MrFOG1、MrHAND2、MrHES1、MrARNT、MrGATA2、MrSOX4和MrRUNXAB,及多个信号通路包括BMP、MAPK、NOTCH、HIPPO通路中关键基因差异表达,提示它们可能在罗氏沼虾附肢的再生中发挥重要作用。3.罗氏沼虾BMP信号通路关键基因dpp、BMPR1B、BMPR2、Smad1以及Smad4的克隆与表达分析基于转录组测序分析结果,候选BMP信号通路作为罗氏沼虾附肢再生的研究方向。通过转录组数据分析筛选出罗氏沼虾BMP2/4、BMPR1B、BMPR2、Smad1及Smad4基因序列,利用PCR扩增技术,克隆得到了这五个基因的cDNA全长,分别为1,612bp、982bp、2,940bp、1,785bp以及2,160bp,分别命名为Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1和MrSmad4,通过推导这五个基因的功能结构域,发现它们均与甲壳动物同源基因高度相似。然后进行各基因的表达特征分析,发现Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1和MrSmad4基因在雌雄罗氏沼虾各组织中的表达差异显著,但各基因均在步足基部肌肉、眼柄及神经组织中的表达相对较高。其次,Mrdpp、MrBMPR2以及Mr Smad1基因在蜕皮周期中的表达规律相似,均在蜕皮后期（A、B）期高表达。最后在罗氏沼虾附肢再生早期阶段检测各基因的表达,结果发现Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1及MrSmad4基因存在组织表达特异性,但总体均呈显著上调趋势,初步推断BMP通路中这5个关键基因参与了罗氏沼虾附肢再生过程。4.利用RNA干扰技术探究BMP信号通路关键基因对罗氏沼虾附肢再生的影响通过体外转录方法获得了Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、Mr Smad1和Smad4等关键基因的ds RNA,首先进行ds RNA-Mrdpp长期体内注射实验,再通过罗氏沼虾附肢再生过程的形态学观察及组织学分析,结果发现,长期注射ds RNA-Mrdpp组罗氏沼虾与对照组罗氏沼虾相比,其附肢伤口愈合时间明显延长,且再生芽基的生长及延长受到严重影响,组织切片结果也证实Mrdpp基因的敲降会影响罗氏沼虾附肢再生部位的伤口愈合。后续进行了罗氏沼虾体外组织孵育实验,结果表明在添加ds RNA-Mrdpp的实验组罗氏沼虾步足基部肌肉组织中,除Mr Smad4基因外,Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、Mr Smad1基因均极显著下调（p<0.01）。再通过BMP I型受体抑制剂（LDN-193189）的体内注射实验,检测罗氏沼虾断肢后BMP信号通路中各基因的表达特征,结果发现,注射抑制剂后,在断肢罗氏沼虾步足基部肌肉及胸节神经组织中MrBMPR1B及Mr Smad1基因均显著下调（p<0.05）,此外,在24h及48h,Mrdpp基因在各组织中均极显著下调（p<0.01）,MrBMPR2基因在眼柄及胸节神经组织中的表达量均显著降低（p<0.05）。最后进行Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1及MrSmad4等关键基因的ds RNA体内注射短期实验,在罗氏沼虾断肢后,分别检测这几个基因在不同组织中的表达特征,结果发现BMP信号通路中各关键基因敲降后,反而引起其他基因的高表达（p<0.05）,此外,下游各基因敲降后,Mrdpp基因均呈显著下调趋势,推测该通路可能存在多水平调控及反馈调节。通过以上的研究明确了BMP信号通路缺失会显著影响罗氏沼虾的附肢再生。5.过表达MrDpp和MrBMPR1B对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响通过构建原核表达载体,获得了重组蛋白pET-Dpp以及重组蛋白pET-BMPR1B,然后进行体外组织孵育实验,实验结果表明,在过表达重组蛋白pET-Dpp以及重组蛋白pET-BMPR1B,均会导致其他基因在不同组织中差异显著表达,但都存在孵育时间及蛋白浓度依赖性;此外发现胸节神经组织很可能是Dpp浓度调控的枢纽,在胸节神经组织中,只有当pET-Dpp重组蛋白浓度适中时,下游各基因显著表达,当浓度过低或过高,均会抑制其他基因的表达（p<0.05）。最后在罗氏沼虾体内进行了pET-Dpp重组蛋白,pET-Dpp重组蛋白与ds RNA-Mrdpp共注射实验,结果发现在注射pET-Dpp蛋白之后,在步足基部肌肉以及眼柄组织中,除MrBMPR1B基因之外所有基因的表达量显著上调（p<0.05）,当共注射pET-Dpp及dsRNA-Mrdpp后,与对照组相比Mrdpp表达量又显著下调（p<0.05）,而其他基因表达差异不显著（p>0.05）。然而,在胸节神经组织中Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1以及MrSmad4基因均在注射pET-Dpp蛋白之后极显著下调（p<0.01）,再次表明在神经组织中过高的pET-Dpp重组蛋白浓度可能导致BMP信号通路基因的显著下调。总的来说,BMP信号通路在罗氏沼虾附肢再生过程发挥关键作用,此外,BMP通路的调控方式复杂,可能存在多水平调控及反馈调节。以上研究结果将有助于更深入的解析甲壳动物再生机制。