论文部分内容阅读
爱滋病的基因治疗需要将能有效抑制艾滋病毒复制的基因导入到HIV的靶细胞内并获得高效表达。锤头型核酶是能够催化切割与之互补的RNA分子的RNA。实验设计了两个锤头型核酶，一个针对HIV—1基因组中的tat基因（TAT—RZ），另一个针对tat基因和rev基因的共有外显子序列（TR—RZ）。通过体外转录合成的这两个核酶在体外可在生理温度下切断HIV—1基因组RNA的靶序列。将编码这两个核酶的基因克隆到逆转录病毒载体LN中。当在细胞内表达的时候，核酶作为编码细菌新霉素抗性序列的一部分而被转录，位于Neo基因编码序列起始密码子的前方。带有核酶基因的逆转录病毒载体被包裹成多受体病毒子，后者用于转化人的CEMT淋巴细胞，用RNA印迹法可很容易地检测到在被转化的CEM细胞含有核酶序列的RNA的表达。表达这两个核酶的CEM细胞对HIV—1的复制具有抑制作用，而表达突变型核酶的细胞，HIV—1的复制不受抑制。突变型核酶是在核酶的核心催化区内有一个关健性碱基被置换，体外证实丧失切割活性。这些结果证实，逆转录病毒载体可在细胞内高效表达核酶，后者可以抑制HIV—1在T细胞内的复制。 为比较不同启动子在T细内表达核酶的活性，探讨核酶两测转录自表达载体的无关序列对核酶体内外活性的影响，探讨核酶的表达强度与细胞内抑制效应间的关系。设计构建了三个逆转录病毒表达载体，核酶（TR—TAT联合体）的表达分别受小鼠白血病病毒LTR、CMV早期基因启动子或tRNA（?）et启动子控制。 应用体外转录系统合成含有不同长度周边序列的核酶进行体外切割实验，结果显示周边序列（最长达2700碱基）对核酶的体外活性没有明显影响。应用包装细胞产生的病毒子转化CEM细胞，用RNA印迹分析和RNase保护实验分析核酶在细胞内的表达水平。结果表明MoMuLV LTR的活性比CMV启动子和tRNA启动子要高10～20倍，载体内插入的外源性启动子大大降低LTR的活性。不同载体转化的CEM细，虽然核酶的表达强度相差很大，但对HIV—1的细胞内复制显示几乎同等程度的抑制效应，这种表达和抑制效应的非正相关性提示周边序列对内部核酶的细胞内活性具有负效应，文章对可能的原因作了简要讨论，并设计合成了新的表达载体，试验正在进行中。