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水体中富营养化程度的增加导致了蓝藻水华频繁发生,而有毒蓝藻水华的爆发引起了人们越来越多的关注。目前发现,有毒蓝藻水华出现在世界各地的富营养化湖泊、池塘和河流中,引起野生动物和家畜疾病及死亡的发生。在全球范围内,微囊藻毒素(MCs)是淡水水华中最常见、分布最广的毒素。现已发现90余种微囊藻毒素的异构体,其中分布最普遍、含量最多的是MC-LR、MC-RR和MC-YR。本文研究了MC-LR对小鼠肝脏组织病理学、基因、蛋白表达和生化酶活性影响,其中利用HE染色观察了MC-LR暴露后小鼠肝脏组织结构的变化;利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)、蛋白质印迹法(western blot)和分光光度计分析了肝脏功能相关基因、蛋白和酶的活性变化;利用RNA测序技术(RNA-seq)分析了MC-LR暴露后小鼠肝脏组织的转录组;利用酶联免疫法(ELISA)分析了MC-LR暴露后小鼠肝脏炎症反应相关的蛋白变化。获得了如下几个方面的实验结果:1.MC-LR亚慢性暴露致小鼠肝细胞凋亡急性毒性实验发现,MC-LR对小鼠腹腔注射的LD50为70μg/kg(56.74-75.6μg/kg)。实验采用亚致死剂量的MC-LR(3.75、7.5和15μg/kg)连续腹腔注射暴露小鼠28 d,染毒7、14、21和28 d分别取材检测。结果发现,7.5和15μg/kg MC-LR暴露21和28d明显增加了小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转移酶(AST)活性,而血清碱性磷酸酶(AKP)活性在所有MC-LR处理组暴露28 d时也显著升高,说明小鼠肝功能受到损伤。同时,MC-LR暴露28 d还引起了小鼠肝脏组织病理学的改变,如7.5和15μg/kg MC-LR处理组引起肝脏炎细胞浸润,而15μg/kg MC-LR处理组还诱导了肝细胞凋亡。为了进一步探讨MC-LR诱导肝细胞凋亡发生机理,本实验又检测了Bcl-2、Bax、cyt c、caspase 3和caspase 9蛋白。结果发现,MC-LR暴露28 d后,Bcl-2蛋白含量比对照组明显下降,而Bax、cyt c、caspase 3和caspase 9蛋白含量升高,表明MC-LR导致的肝细胞凋亡可能通过Bax-cyt c-caspase 9-caspase 3的线粒体通路介导。2.亚慢性MC-LR暴露对小鼠肝脏的氧化损伤及其对Nrf2通路的影响实验还检测了MC-LR(3.75、7.5和15μg/kg)暴露28 d对小鼠肝脏的氧化损伤及其对核因子E2相关因子2(Nrf2)调控蛋白和酶活性的影响。结果发现,处理组Nrf2蛋白含量从MC-LR暴露14 d开始处于持续升高状态,表明MC-LR诱导了Nrf2的表达。MC-LR暴露7 d后显著增加了超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)酶活性,醌氧化还原酶1(NQO1)、半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白含量也较对照组增加,这些抗氧化酶和解毒酶活性的增加提高了肝脏清除ROS的能力。随着暴露时间的延长,尽管谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性、GCLC和HO-1蛋白含量依旧高于对照组,但SOD、CAT、GPx活性和NQO1蛋白含量下降,同时T-AOC也显著下降,表明肝脏抗氧化能力下降。与对照组相比,高剂量组(7.5和15μg/kg)在MC-LR暴露21 d活性氧(ROS)显著升高,28 d所有处理组均明显升高。同时,7.5和15μg/kg MC-LR暴露28 d也导致了丙二醛(MDA)含量的升高。结果表明,Nrf2调控的抗氧化酶和解毒酶在保护机体免受MC-LR毒性中可能起重要作用。3.MC-LR暴露对小鼠肝脏细胞色素P450代谢酶的影响细胞色素P450(CYP)是Ⅰ相代谢酶的主要成员,其中参与外源性化学物质代谢和生物转化的主要是CYP1、CYP2和CYP3 3个家族。本实验用低剂量的MC-LR(2、4、和8μg/kg)连续7 d腹腔注射小鼠染毒,在1、3和7 d取材检测肝脏CYP1A1、CYP2E1和CYP3A11 m RNA、蛋白和酶活水平变化。结果表明,MC-LR显著抑制了小鼠肝脏7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶(EROD)活性,但仅2μg/kg MC-LR处理组抑制了小鼠CYP1A1 m RNA表达(1和3 d)。同时,CYP1A1蛋白水平变化和EROD酶活性变化也不一致,表明MC-LR抑制EROD酶活性的机制可能涉及到转录后和翻译后水平的调控。MC-LR暴露上调小鼠肝脏CYP3A11 m RNA水平,但降低其蛋白含量。同时,MC-LR在整个暴露时间点和暴露剂量组都明显抑制小鼠红霉素N-脱甲基酶(ERND)酶活性。MC-LR能显著增加小鼠肝脏CYP2E1 m RNA、蛋白水平和苯胺羟化酶(ANH)酶活性,表明CYP2E1可能参与了MC-LR在小鼠肝脏中的代谢。而且,MC-LR暴露丙酮诱导CYP2E1高表达小鼠时发现,血清酶ALT、AST活性和肝脏ROS含量和MC-LR处理组相比显著升高,表明CYP2E1可能在代谢MC-LR时诱导产生ROS并与MC-LR的肝毒性及其代谢相关。4.MC-LR暴露后小鼠肝脏转录组学分析为深入探讨MC-LR毒性作用的分子机制,我们采用了以RNA-seq技术为基础的数字基因表达谱分析。实验用10和40μg/kg MC-LR暴露小鼠24 h后检测处理组和对照组肝脏组织的基因表达谱变化,从中找出差异表达基因(DEGs),用基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)对这些DEGs进行深入分析。结果发现,10μg/kg处理组有402个基因显著上调、38个基因显著下调;40μg/kg处理组有72个基因显著上调、76个基因显著下调。GO生物学过程富集分析发现,10μg/kg MC-LR处理组DEGs显著富集了10个GO terms,其中和免疫相关的有innate immune response(GO:0045087),defense response(GO:0006952)和response to bacterium(GO:0009617)。40μg/kg MC-LR处理组DEGs未发现显著富集的GO terms。KEGG分析发现,10μg/kg MC-LR暴露后小鼠肝脏DEGs参与的生物学通路显著富集了47条,其中和肝脏免疫相关通路有17条;而40μg/kg MC-LR处理组小鼠肝脏DEGs参与的生物学通路显著富集了5条。数字基因表达谱分析表明,肝脏炎症反应可能在MC-LR毒性中起重要作用。5.MC-LR暴露致小鼠肝脏炎症反应及其机理实验用5、10、20和40μg/kg MC-LR连续腹腔注射小鼠染毒7 d,在1、3和7 d时取材检测。实验检测发现,MC-LR暴露小鼠主要诱导了促炎因子IL-6、IL-18和MIF的表达。同时,MC-LR暴露抑制了抑炎因子IL-2表达,促进了IL-4和IL-10的表达。该实验结果表明,MC-LR暴露干扰了小鼠肝脏促炎/抑炎平衡,导致肝脏的炎症反应及肝功能损伤。实验还发现,所有MC-LR处理组均促进Toll样受体6(TLR6)和TLR9的表达,说明TLR6和TLR9在MC-LR所致小鼠肝脏炎症反应中可能起重要作用。同时,较高剂量MC-LR(40μg/kg)暴露还显著增加TLR1、TLR2、TLR11和TLR13的表达,说明高剂量的MC-LR急性暴露可能通过诱导/激活大部分TLRs而介导其炎症反应。主要研究结论1.亚慢性MC-LR暴露引起小鼠肝脏损伤,可能通过线粒体途径介导细胞凋亡。2.Nrf2通路在保护机体免受MC-LR毒性中起重要作用。3.CYP2E1可能参与肝脏代谢MC-LR,同时代谢过程中会产生过量ROS,对机体造成氧化损伤。4.MC-LR影响小鼠肝脏促炎/抑炎平衡并造成炎症反应,可能通过TLRs介导该炎症反应。