论文部分内容阅读
背景和目的慢性脑缺血（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是临床上常见的病理状态，临床上一般指由于长期脑血供不足导致的头晕、头重或异麻感等，它可能在动脉粥样硬化、Alzheimer’s病（AD）、血管性痴呆（vascular dementia，VD）、Parkinson病等多种疾病的病理过程中有重要作用，尤其是近年来有研究表明它可能是AD最重要的启动和维持机制之一。尽管CCH致AD的病机不十分清楚，但血管因素为临床防治AD提供了一个方向，这使得扩血管物质一氧化氮（nitric oxide，NO）成为防治AD的靶点之一。NO由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化产生，是一种重要的扩血管物质，也是中枢神经系统中重要的神经递质，它既能作为突触传递的长时程增强（long term potentiation，LTP）效应的关键信使在学习记忆中发挥重要作用，也参与急性缺血性脑损伤的发生和发展。NOS分三型，在急性脑缺血时，内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）产生的NO有神经保护作用，而神经型NOS（neuronal NOS，nNOS）和诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）过度表达所产生的NO有神经毒性作用（也有研究表明nNOS有保护作用）。寻求能对NOS亚型进行选择性干预的药物也可能具有潜在的临床价值。但是，在CCH所致痴呆的病理过程中，NO／NOS是否也和急性缺血一样有双重作用尚缺乏相关研究。尼莫地平作为Ca2+通道拈抗剂具有神经保护作用，临床上可用来防治痴呆，其具体机制不明。本试验拟用双侧颈总动脉结扎制作CCH大鼠模型，并用尼莫地平进行干预，观察大鼠认知能力的变化和海马CA1区NOS亚型的表达情况，由此探讨NOS亚型在CCH中的作用和尼莫地平的神经保护机制，为尼莫地平防治痴呆提供进一步的实验依据。材料与方法1．实验动物分组：选用10～12个月的健康雄性SD大鼠30只，体重300～350g，随机分为三组：假手术组、单纯缺血组和缺血治疗组，每组10只。2．动物的处理：（1）钝性分离单纯缺血组和缺血治疗组大鼠双侧颈总动脉，用0号手术线分别结扎其近心端及远心端，并从中间剪断；分离假手术组双侧颈总动脉但不结扎，也不剪断。术后各组大鼠均在常规条件下饲养60天。术前及术后每周测量血压1次。（2）缺血治疗组于术后24小时开始灌胃，尼莫地平用0.5％羧甲基纤维素钠溶液溶化后按1mg／kg灌胃，每天两次，连续60天。单纯缺血组和假手术组分别灌以等量0.5％羧甲基纤维素钠溶液。（3）手术60天后用Y型迷宫对每组大鼠进行认知能力测试。（4）认知能力测试后处死大鼠，脑组织用4％的多聚甲醛固定后石蜡切片，做HE染色和免疫组化染色。3．观察指标：（1）血压：用无创血压计测尾动脉血压，观察造模及尼莫地平是否影响血压。（2）认知能力：采用Y型电迷宫进行主动逃避学习能力测试。大鼠学习成绩以达到连续10次测试中有至少9次（≥90％）正确反应时所需的电击次数表示。（3） HE染色：光镜下观察脑组织病理变化。（4）用免疫组化法观察nNOS、iNOS和eNOS的表达，观察6个不连续的高倍视野，测灰度值。5．统计方法：所有数据用均数±标准差（（?）±s）表示，采用统计软件SPSS10.0进行数据处理，用单因素方差分析进行组间比较，取α=0.05作为检验水准。结果1．一般情况：术后大鼠均出现精神萎靡，反应迟钝，进食减少，术后1天假手术组精神恢复，反应灵敏，进食增多，缺血治疗组有所改善但相对较差。饲养过程中，假手术组反应灵敏，而单纯缺血组精神萎靡，反应迟钝，自洁能力差，缺血治疗组介于二者之间。各组手术前后血压无明显变化（P＞0.05），缺血治疗组用尼莫地平前后血压无明显变化（P＞0.05）。2．认知能力：假手术组、单纯缺血组和缺血治疗组达到标准所需电击次数分别为35.50±5.10、81.60±5.95、58.60±7.23，相互之间差异有统计学意义（P＜0.01），提示造模后认知能力下降，经尼莫地平治疗后，认知能力改善。3．HE染色：假手术组偶有神经细胞变性、死亡，大部分细胞形态正常未发现明显的病理变化；单纯缺血组见大量神经细胞变性、坏死，核浓缩，空泡变性，白质内出现散在性神经纤维及髓鞘溃变；缺血治疗组变性、死亡神经细胞较单纯缺血组明显减轻。4．nNOS免疫组化染色：取海马CA1区进行统计分析，假手术组、单纯缺血组及缺血治疗组nNOS灰度值分别为57.50±10.11、34.90±5.22、43.10±6.56，相互之间差异有统计学意义（P＜0.01），提示造模后nNOS表达下降，经尼莫地平治疗后，nNOS表达提高。5．iNOS免疫组化染色：取海马CA1区进行统计分析，假手术组、单纯缺血组及缺血治疗组iNOS灰度值分别为10.40±3.50、82.70±2.80、63.60±6.57，相互之间差异有统计学意义（P＜0.01），提示造模后iNOS表达上调，经尼莫地平治疗后，iNOS表达下降。6．eNOS免疫组化染色：取海马CA1区进行统计分析，假手术组、单纯缺血组及缺血治疗组eNOS灰度值分别为62.40±4.20、21.20±2.74、38.30±3.13，相互之间差异有统计学意义（P＜0.01），提示造模后eNOS表达下降，经尼莫地平治疗后，eNOS表达提高。结论1．CCH使海马CA1区nNOS和eNOS表达下降，iNOS表达升高，这些改变都与认知功能障碍有关。2．iNOS高表达的神经毒性损伤了nNOS和eNOS神经细胞，导致LTP障碍，这可能是CCH促发认知功能障碍的原因之一。本试验不支持nNOS在CCH中发挥毒性作用。3．尼莫地平可以减轻CCH后的神经细胞损伤并改善认知功能，其机制可能与抑制iNOS的表达并提高nNOS和eNOS的表达有关。