禽流感是危害家禽养殖业的主要传染病，按致病力可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。低致病性禽流感主要感染鸭等水禽，其发病率和死亡率虽低，但可以在宿主体内长期复制并排毒，对家禽养殖业和公共卫生构成严重的潜在威胁。禽流感主要通过呼吸道等方式传播，研究表明鼻腔免疫可以在呼吸道局部诱导高效的免疫应答，切断禽流感病毒的呼吸道传播途径，从而预防禽流感。禽流感鼻腔免疫时，单独灭活病毒免疫效果往往不够理想，且呼吸道黏膜的天然屏障作用和粘液纤毛清除作用也给鼻腔疫苗的跨上皮转运带来了极大困难，使转运（吸收）问题成为鼻腔疫苗发展的瓶颈。研究表明，包括免疫刺激剂、促吸收剂在内的黏膜免疫佐剂能很好的解决以上问题。高效的黏膜免疫应答是疫苗和机体黏膜免疫系统相互作用的结果，鼻腔免疫在不同种属动物间差异较大，主要与鼻腔的解剖结构、组织学特点以及鼻相关淋巴组织的分布有关。但是目前在鸭等水禽中，尚无系统的鼻腔解剖组织学研究和物质转运能力研究，尚无鼻腔免疫预防低致病性禽流感的相关研究，对黏膜佐剂的作用机制研究较少。因此，本研究以鸭为研究对象，对鼻腔解剖结构和组织学特点进行系统研究;并用不同抗原性和粒径大小的模式吸收物质以及禽流感灭活病毒(Inactivated avian influenza virus，IAIV)对其物质转运能力进行评价;进而选取传统免疫刺激剂CpGDNA、中药佐剂黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）和促吸收剂胆酸钠三种黏膜佐剂，并搭配成复合佐剂配合IAIV对雏鸭进行鼻腔免疫，研究鸭呼吸道局部和全身免疫水平的变化。此外，本研究成功建立了鸡骨髓源树突状细胞的体外培养诱导模型，从抗原识别和呈递角度对CpG和APS的作用机理进行了初步探讨，以期为鼻腔免疫的研究和应用提供一定的理论依据。试验分为以下四章:　　1.鸭鼻腔解剖结构和组织学特点研究　　取7、21、35和60日龄樱桃谷鸭进行鼻腔解剖结构和组织学特点研究，结果发现:　　(1)7日龄鸭的鼻腔基本发育成型，但其黏膜上皮较薄，鼻黏膜细胞分化程度不高;随着日龄的增加鼻腔发育逐渐成熟，60日龄前鼻腔中淋巴组织的数量和面积一直呈增长趋势。　　(2)鸭鼻腔由前庭区、呼吸区和嗅区组成，分别分布有前、中和后鼻甲。鼻腔前部主要为复层扁平上皮，其余部分主要为假复层柱状纤毛上皮，其间密集分布有杯状细胞构成的分泌腺。　　(3)鸭鼻腔中后部鼻中隔和鼻后口两侧分布有两对位置固定的鼻相关淋巴组织(NALTs)，其滤泡相关上皮（FAE）主要由单层纤毛或无纤毛细胞构成。其他位置的鼻腔黏膜中随机分布有弥散的淋巴组织，主要为Ⅰ型滤泡。　　(4)鸭NALTs的FAE区域很有可能存在M细胞，但是免疫组织化学研究未能发现其有效的鉴定标志。　　2.鸭鼻腔对不同粒径大小模式吸收物质和IAIV吸收能力的研究　　应用小分子物质台盼蓝和OVA、大粒径物质荧光乳胶颗粒和IAIV对14日龄鸭进行滴鼻，运用组织化学、免疫组织化学和激光共聚焦观察不同物质在鸭鼻腔中的吸收情况，结果发现:在一定浓度和剂量时鸭鼻腔黏膜可以广泛吸收台盼蓝，可将其吸收或摄取至固有层中，台盼蓝基本不进入NALTs和弥散淋巴组织部位。OVA在鸭鼻腔中的吸收情况和台盼蓝类似，但黏膜下淋巴组织对其吸收能力要强于台盼蓝。鸭鼻腔黏膜上皮和淋巴组织可以吸收或摄取50nm以下乳胶颗粒，但对100nm乳胶颗粒的吸收能力较弱。鸭鼻腔对IAIV的吸收情况和乳胶颗粒类似，但NALTs对IAIV的吸收能力明显强于100nm乳胶颗粒。鸭鼻腔前部的复层扁平上皮对上述物质均不吸收。CpG或胆酸钠配合IAIV滴鼻后，可以显著促进IAIV在NALTs处的吸收。　　3.不同黏膜免疫佐剂对鸭呼吸道局部和系统免疫水平的影响　　将CpG DNA、APS和胆酸钠三种佐剂搭配成复合佐剂，配合H9N2 IAIV对雏鸭进行鼻腔免疫，并以肌肉注射免疫作为参考，应用组织化学、免疫组织化学、免疫血清学、放射性免疫和酶联免疫吸附等试验方法对鸭呼吸道局部和系统免疫水平进行评价，并进行攻毒保护试验。结果发现:　　(1)应用由CpG和SC、APS和SC、CpG和APS和SC组成的三种复合佐剂配合IAIV鼻腔免疫后，相对于单独IAIV免疫组，气管组织中上皮内淋巴细胞（第5周和第7周）和喉组织中肥大细胞（第7周）数量显著增加;气管和肺组织中IL-2和IL-6的表达水平（二免后28h）显著升高;但APS和SC复合佐剂组的促进效果不及其他两组复合佐剂;单独CpG配合免疫对肺组织中IL-2和IL-6水平也有显著的提高作用。　　(2)三种复合佐剂配合IAIV鼻腔免疫后第3、5和7周，相比于单独佐剂组显著提高了喉、气管和气管又组织中IgA和IgG抗体分泌细胞的面积以及禽流感特异性IgA和IgG抗体水平;单独CpG或单独APS配合IAIV鼻腔免疫对局部特异性抗体水平也有一定的提高作用。　　(3)三种复合佐剂配合IAIV免疫后第3周至第7周，相比于单独佐剂组显著提高了血清中禽流感特异性IgA和IgG抗体水平以及HI抗体滴度，肌肉注射免疫后血清抗体水平略高于鼻腔免疫。　　(4)攻毒保护试验表明三种复合佐剂配合IAIV鼻腔免疫可以有效地保护免疫鸭群，并能显著抑制排毒。　　4.CpG和APS对鸡骨髓源树突状细胞的表型和TLRs信号通路的影响　　从20-30日龄雏鸡中分离骨髓细胞，用重组鸡CM-GSF和IL-4进行诱导，成功的建立了鸡骨髓源树突状细胞(chBM-DC)分离和体外诱导培养模型，培养至第6天的细胞呈现典型的树突状细胞(DC)形态，经表型鉴定纯度可达60～70％。运用CpG、APS以及CpG和APS刺激chBM-DC，结果发现:CpG可以有效地刺激chBM-DC的TLRs，并引起TLRs信号通路中TLR9、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子3和6（TRAF3和TRAF6）、NF-κB亚单位P50、核转录因子IRF7等mRNA表达量显著上调;并通过激活经典的NF-κB信号通路，引起下游效应因子IFN-γ、IL-1、IL-6和IL-10等mRNA表达量的显著上调。单独APS刺激没有激活chBM-DC的TLRs信号通路，但CpG和APS共同刺激时对TLRs信号通路关键因子的mRNA表达量上调表现出一定的协同作用。