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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度传染的病毒性疾病，给全世界范围的生猪养殖业带来巨大经济损失。近年来PRRS在我国大面积爆发，究其原因是当前疫苗免疫不能对猪群产生较好保护。脂质是机体内的重要组成成分，在调控机体功能上发挥着极其重要的作用。大量研究表明病毒与脂质代谢之间存在复杂的关系，但是脂质代谢在PRRSV感染机制尚不清楚。
本研究首先采用RT-PCR检测N-Myc下游调节基因1(NDRG1)mRNA在猪不同组织中的表达水平。以猪白色脂肪组织cDNA为模板克隆NDRG1编码区并构建p3×FLAG-CMV-10-NDRG1重组质粒。共聚焦显微镜观察NDRG1与不同细胞器标记物共定位。PRRSV BJ-4感染MARC-145细胞通过RT-PCR、Western blot、免疫荧光等检测方法检测NDRG1mRNA和蛋白表达水平。利用shRNA技术构建NDRG1敲低细胞系，RT-PCR和Western blot检测敲减效率。CCK试剂盒检测敲减NDRG1对细胞增殖是否有影响。PRRSV-GFP和PRRSV BJ-4病毒分别感染敲减NDRG1细胞系通过荧光显微镜观察、流式细胞仪检测、病毒滴度测定、RT-PCR和Western blot检测对病毒增殖影响。免疫荧光和Westernblot检测过表达NDRG1对病毒增殖影响。病毒滴度测定、免疫荧光和RT-PCR等方法检测敲减NDRG1对病毒生活周期影响。油红O和Bodipy染色敲减NDRG1细胞系观察细胞内脂滴变化。RT-PCR和Western blot检测细胞内脂质合成和脂质分解的关键基因表达。Western blot和免疫荧光检测敲减NDRG1是否诱导自噬。
试验结果表明，NDRG1mRNA在猪白色脂肪组织中表达最高。亚细胞器定位结果显示NDRG1定位于内质网。PRRSV感染显著下调NDRG1mRNA和蛋白表达。MARC-145细胞敲低NDRG1虽然不影响细胞增殖，但是显著促进PRRSV复制。相反，在MARC-145细胞中过表达NDRG1明显抑制PRRSV复制。病毒生活周期结果表明敲低NDRG1影响PRRSV复制和组装，不影响病毒吸附、进入和释放。进一步研究发现敲低NDRG1促进脂质分解。机制研究表明敲低NDRG1不影响脂质合成酶(ACC1，FASN，SCD-1)和脂质分解脂酶(ATGL，HSL,MGL)表达，但是促进细胞自噬。自噬抑制剂3-MA处理敲低NDRG1细胞能够抑制自噬和脂质分解，进而抑制PRRSV复制。以上研究结果揭示PRRSV感染下调NDRG1表达，促进自噬介导的脂解，从而促进病毒复制。这些研究结果不但揭示了PRRSV感染与宿主细胞脂质代谢的内在联系，而且为PRRSV的防控提供理论依据。
本研究首先采用RT-PCR检测N-Myc下游调节基因1(NDRG1)mRNA在猪不同组织中的表达水平。以猪白色脂肪组织cDNA为模板克隆NDRG1编码区并构建p3×FLAG-CMV-10-NDRG1重组质粒。共聚焦显微镜观察NDRG1与不同细胞器标记物共定位。PRRSV BJ-4感染MARC-145细胞通过RT-PCR、Western blot、免疫荧光等检测方法检测NDRG1mRNA和蛋白表达水平。利用shRNA技术构建NDRG1敲低细胞系，RT-PCR和Western blot检测敲减效率。CCK试剂盒检测敲减NDRG1对细胞增殖是否有影响。PRRSV-GFP和PRRSV BJ-4病毒分别感染敲减NDRG1细胞系通过荧光显微镜观察、流式细胞仪检测、病毒滴度测定、RT-PCR和Western blot检测对病毒增殖影响。免疫荧光和Westernblot检测过表达NDRG1对病毒增殖影响。病毒滴度测定、免疫荧光和RT-PCR等方法检测敲减NDRG1对病毒生活周期影响。油红O和Bodipy染色敲减NDRG1细胞系观察细胞内脂滴变化。RT-PCR和Western blot检测细胞内脂质合成和脂质分解的关键基因表达。Western blot和免疫荧光检测敲减NDRG1是否诱导自噬。
试验结果表明，NDRG1mRNA在猪白色脂肪组织中表达最高。亚细胞器定位结果显示NDRG1定位于内质网。PRRSV感染显著下调NDRG1mRNA和蛋白表达。MARC-145细胞敲低NDRG1虽然不影响细胞增殖，但是显著促进PRRSV复制。相反，在MARC-145细胞中过表达NDRG1明显抑制PRRSV复制。病毒生活周期结果表明敲低NDRG1影响PRRSV复制和组装，不影响病毒吸附、进入和释放。进一步研究发现敲低NDRG1促进脂质分解。机制研究表明敲低NDRG1不影响脂质合成酶(ACC1，FASN，SCD-1)和脂质分解脂酶(ATGL，HSL,MGL)表达，但是促进细胞自噬。自噬抑制剂3-MA处理敲低NDRG1细胞能够抑制自噬和脂质分解，进而抑制PRRSV复制。以上研究结果揭示PRRSV感染下调NDRG1表达，促进自噬介导的脂解，从而促进病毒复制。这些研究结果不但揭示了PRRSV感染与宿主细胞脂质代谢的内在联系，而且为PRRSV的防控提供理论依据。