背景：创伤、肿瘤、手术以及骨折不愈合等原因常常造成骨质的缺失,成骨细胞难以爬过间隙而不能发生正常的愈合过程,最后形成骨不连。人体自身的自体骨具有良好的骨诱导作用,然而受到同种骨和异种骨来源供应的限制。同种异体骨存在传播疾病的危险和发生免疫排斥反应的可能,临床应用受到一定的限制。使用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate, PMMA)骨水泥通过增强内固定物周围的松质骨达到强化内固定的目的。但是,由于PMMA固化时放热,不能被机体吸收和重塑,阻碍骨折愈合,这些缺点,大大限制了其临床应用的范围。近年来,以磷酸钙为代表的无机人工骨替代材料的研发得到很大发展。华东理工大学刘昌胜教授及其合作者在上海市科委重点项目(98JC 14015)资助下,研制成功了可吸收的新型无机骨水泥即磷酸镁骨水泥(Magnesium Phosphate Cement, MPC)。通过成果鉴定(沪科鉴02 G00182)研究水平达到国际先进,并己获得专利。专利授权号为ZL01105373.9；PTC国际专利：PTC/CN01/00282。在市科委的资助下(2003年9月至2006年9月,面上项目,编号为：034119904),经初步研究显示：MPC粘结强度明显大于传统的磷酸钙骨水泥,可以对细小非负重区域的骨折片能直接进行粘合；材料同周围骨质紧密结合,界面处未出现明显的炎性细胞聚集和纤维膜,未引起异物反应,无内脏毒性,经过初步实验研究结果是满意的。体内植入材料后,该材料及其代谢产物是否对周围组织细胞产生影响,是否有遗传毒性、致癌性和生殖毒性,特别是对成骨细胞的增殖和分化速度产生影响,以及是否对周围组织的细胞产生致突变的作用也有待于进一步研究。此外其在活体内是否会激活细胞炎性因子,引发免疫反应异常,目前还没有确切数据,这也将是研究的一个内容。目的：磷酸镁骨粘合剂自研发以来,经初步研究显示其粘结强度明显大于传统的磷酸钙骨水泥,可以对细小非负重区域的骨折片能直接进行粘合；材料同周围骨质紧密结合,界面处未出现明显的炎性细胞聚集和纤维膜,未引起异物反应,无内脏毒性。所以MPC的生物学特性,经过初步实验研究结果是满意的。但对于植入新材料,本课题将研究该材料及其代谢产物是否对周围组织细胞产生影响,特别是对成骨细胞的增殖和分化速度产生影响,是否对周围组织的细胞产生致突变的作用,在活体内是否会激活细胞炎性因子,引发免疫反应异常,符合生物安全性的要求,检测其生物相容性是否良好。方法：根据研究目的,本课题分成三个部分。1遗传毒性试验：(1)Ames试验：将磷酸镁骨粘合剂制备浸提液,采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验),取以生理盐水为阴性对照,取特定阳性物为阳性组,在添加大鼠肝脏微粒体酶S9的情况和不添加S9的情况下,测试各个组对各种鼠伤寒沙门菌(TA100、TA102、TA97 and TA98)的致突变比值(MR)。致突变比值(MR)=实验组回变菌落数(Rt)／阴性对照组回变菌落数(Rc),将突变比值做统计分析,观察MPC浸提液对菌株有无回复突变影响。(2)程序外DNA合成试验：取人的外周全血,取不同浓度的MPC浸提液做试验,生理盐水作为阴性对照组,硫酸镍为特定阳性组,RPMI 1640细胞培养液内加入羟基脲和3H-TdR,共同培养后,震荡,终止反应后,收集细胞,洗涤、固定、脱水；加入闪烁液,计数仪上做放射性测量。测试结果用每分钟放射计数(cpm)代表DNA合成。(3)微核试验：取健康成熟昆明雄性小鼠分成三组,不同浓度的MPC浸提液作为试验组,生理盐水为阴性对照组,环磷酰胺为阳性组,在小鼠腹腔内定期注射,间隔24小时,分四次给药法。提取骨髓腔内嗜多染红细胞(PCG),涂片、固定、染色、显微镜下计数微核、计算出现微核的百分比。2体外细胞毒性试验：(1)四唑盐比色试验：简称MTT试验。取第三代小鼠成骨细胞(OB),制成细胞悬液,不同浓度的MPC浸提液为试验组,普通细胞培养液为正常对照组,观察1天、3天、5天后终止,加入MTT和二甲基亚砜(DMSO),用酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度(0D)值,计算细胞相对增殖率(RGR),并分级细胞毒性。(2)碱性磷酸酶(ALP)测定试验：取第三代小鼠成骨细胞,制成细胞悬液,不同浓度的MPC浸提液为试验组,酚标准液作为标准组,双蒸水作为空白组,普通的10%DMEM细胞培养液作为阴性对照组。培养观察1、3、5天后终止,用碱性磷酸酶试剂盒检测后,用酶联免疫检测仪在510nm波长下测定光吸收值,计算酚含量。3细胞炎性因子表达测试试验：取第三代小鼠成骨细胞,制成细胞悬液,将不同浓度的MPC浸提液作为试验组,细胞培养液作为阴性对照,用IL-1β、IL-6、TNF-a抗原抗体试剂盒做双抗体夹心法测定,观察1、3、5天后终止,底物液显色,酶标仪450nm处读数,绘制曲线图分析。结果：1在Ames试验中,TA100、TA102、TA97、TA98菌株阳性对照组回变菌落数均超过阴性对照组2倍以上(MR>2)；MPC浸提液不同浓度剂量组对菌落平均数与阴性对照组的比值均小于2(MR<2)；2 UDS试验中,不同浓度的MPC浸出液的每分钟放射计数(CPM)值有浓度依赖性,随着浸出液的浓度增加,CPM值也逐步增加；不同浓度MPC浸提液的CPM值均远低于阳性对照组(不同浓度NiS04)的CMP值；3微核试验中,环磷酰胺阳性对照组微核率比阴性组高10多倍,与MPC浸提液组的微核数值也相差10倍多；不同浓度的MPC微核率,与阴性对照组无显著差异；不同浓度的微核率不与浓度梯度相应,与生理盐水阴性组接近,不会引起嗜多染红细胞的微核率增加；4 MTT试验中,MPC试验组小鼠成骨细胞相对增殖率(RGR)在1、3、5天时分别为87.37%~115.13%、98.96%~118.96%和88.46%~108.92%；细胞毒性分级均为0或1级；不同浓度的MPC浸出液对细胞生长无明显影响；5 ALP检测试验,随着浸提液浓度的提高,ALP值有所下降；不同浓度的MPC浸提液的ALP值与阴性对照组相比,统计学上无明显差异性,不会影响成骨细胞正常生长。6细胞炎性因子表达测定试验,随着浸提液浓度的提高,炎性因子的表达没有显著增加；不同浓度的MPC浸提液与阴性对照组相比,统计学上无明显差异性,分子水平不会促进炎性因子的表达。结论：1磷酸镁骨粘合剂不会引起鼠伤寒沙门菌的回复突变数增加,不会引起基因改变：2磷酸镁骨粘合剂浸出液对DNA无损伤作用；3磷酸镁骨粘合剂对动物骨髓红细胞不会产生微核突变效应,对动物体内短期内无致突变作用；4磷酸镁骨粘合剂对成骨细胞生长无明显影响,对细胞无明显毒性,有良好的细胞相容性；5磷酸镁骨水泥在细胞分子水平不会促进炎性因子的表达,不会诱发炎性反应。