NK细胞是一种重要的固有淋巴细胞,在肿瘤的免疫监视以及清除中起到十分重要的作用。体外实验证实,小鼠和人的NK细胞能够杀伤造血系统来源的多种肿瘤细胞;而体内实验也证明小鼠的NK细胞能够对移植性或者自发性的肿瘤进行有效的清除。另外,一项持续11年的随访研究发现,外周血中NK细胞活性较低的人群,患癌症风险要明显高一些。因此,目前NK细胞被认为是一种抗肿瘤免疫治疗十分有前景的靶点而受到广泛的关注。在抗肿瘤的过程中,NK细胞通过“missing self”的机制识别肿瘤细胞并活化。一方面,与肿瘤细胞直接接触的NK细胞可以通过分泌穿孔素(Perforin)和颗粒酶B(Granzyme B)等细胞毒性分子直接裂解并杀伤肿瘤细胞;另一方面,NK细胞可以通过分泌细胞因子,主要是IFN-γ,参与免疫系统的调控而促进体内的抗肿瘤免疫反应。NK细胞的活性水平受到细胞内和细胞外的多种因素影响,比如细胞内的T-bet、Eomes和Foxo1等转录因子和细胞外的IL-15、IL-2、IL-18和IL-12等细胞因子。最近几年,研究者们发现NK细胞的功能还受到其代谢状态的密切调控,当NK细胞受到细胞因子或者病毒刺激而活化时,细胞内的代谢状态会从静息时的以氧化磷酸化为主转变为以糖酵解为主,而如果抑制了NK细胞的代谢状态转变,则会导致NK细胞不能被刺激而活化。而mTOR信号通路作为细胞内代谢调控的核心通路,尤其是mTORC1信号通路,被发现可以通过调控NK细胞的代谢状态而参与对NK细胞功能的调控。当NK细胞在体内或者体外被刺激活化时,都可以观察到NK细胞内mTORC1信号通路的活性显著升高,而用mTORC1的特异性抑制剂Rapamycin处理NK细胞,不但mTORC1的活性受到了抑制,还由此导致NK细胞活化时的代谢水平显著下降,最终导致NK细胞功能水平受到抑制。另外,通过敲除mTORC1信号通路上游的抑制性分子TSC1而使NK细胞内mTORC1信号通路持续活化,会使NK细胞维持在持续活化的状态,但是由于过度活化会导致细胞耗竭,因此NK细胞内特异性敲除TSC1的小鼠体内,NK细胞的数量严重减少,由此表现出NK细胞功能不足的状态。但是,对于NK细胞个体而言,mTORC1信号通路的活性与NK细胞的功能表现出正向相关的关系。虽然正常情况下NK细胞对肿瘤细胞具有有效的杀伤作用,但是体内NK细胞抗实体瘤形成的有效性却一直受到质疑。这主要是因为在肿瘤形成区域,肿瘤细胞自身及其形成的特定的微环境具有显著的免疫抑制作用,这也是肿瘤细胞能够逃脱免疫监视,耐受免疫反应的重要因素之一,但其具体机制尚不清楚。既往研究发现肿瘤微环境抑制NK细胞抗肿瘤作用的主要机制是基于改变NK细胞表面受体与靶细胞表面配体结合,抑制NK细胞的活化,从而抑制NK细胞的功能。另外,肿瘤细胞分泌的microRNA或通过自噬途径降解NK细胞的效应蛋白Perforin或Granzyme B,从而使肿瘤细胞躲避NK细胞的杀伤[1]。但肿瘤微环境下NK细胞自身发生了何种适应性改变从而导致了NK细胞功能的抑制等科学问题亟待阐明。阐明这一科学问题将为基于NK细胞为靶点的抗肿瘤免疫治疗新策略提供新的实验依据和理论参考。在本研究中,我们参考Ende Zhao等人的研究(Nat Immunol,2016),利用肿瘤细胞培养3天后的反复冻融的培养基,在体外模拟肿瘤微环境,初步研究肿瘤微环境对NK细胞功能的影响及可能机制。方法:(1)将K562细胞培养3天以后,收集细胞与培养基反复冻融得到肿瘤培养基(tumor组),对照1(Control-1)为含K562细胞的新鲜培养基,对照2(Control-2)为K562细胞培养3天后的上清,两个对照组都与肿瘤培养基一起反复冻融,正常培养基组为含10%FBS的1640培养基。(2)NKL细胞在Normal、Control-1、Control-2、tumor这四组培养基中培养24h后,流式检测Perforin、Granzyme B、CD69和NKG2D;NKL细胞在这4组培养基培养24h后,再用PMA或K562细胞刺激,ELISA和流式检测IFN-γ,流式检测与K562共培养后NKL细胞CD107a的表达以及K562的凋亡情况。(3)Seahorse XF检测NKL细胞在Normal、Control-1、Control-2、tumor这四组培养基中培养24h后的耗氧率(OCR)以及细胞外产酸量(ECAR);流式检测四组培养基培养24h后NKL细胞P-S6、P-AKT的表达。(4)将肿瘤培养基的pH值调节到正常组水平或添加葡萄糖、谷氨酰胺及亮氨酸后,流式检测P-S6表达水平。(5)NKL细胞在四组培养基中培养24h后,TMRE染色检测线粒体膜电位;mitotracker检测线粒体数目;CYTO-ID试剂盒检测自噬水平;DCF-DA染色检测细胞ROS水平,mitosox染色检测线粒体ROS水平。(6)NKL细胞在四组培养基中培养24h后,分别用活性氧清除剂还原性谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、MitoTempol处理1h,检测ROS水平、P-S6表达情况以及IFN-γ分泌情况。结果:(1)肿瘤培养基模拟的体外肿瘤微环境显著抑制NK细胞分泌IFN-γ和直接细胞毒作用。NKL细胞在Control-2、tumor两组培养基中培养过后,显著抑制了分泌IFN-γ的能力,并且降低了细胞毒性分子Perforin和GranzymeB的表达水平。在与K562细胞共培养的实验中,Control-2、tumor两组培养基抑制了CD107a的表达,并损害了NK细胞对K562细胞的直接杀伤。但是NK细胞表面的活化性受体CD69、NKG2D没有变化。(2)肿瘤培养基模拟的体外肿瘤微环境显著抑制NK细胞的代谢水平和mTORC1的活性。Seahorse XF检测发现在Control-2、tumor两组培养基中,NK细胞的耗氧率(OCR)以及细胞外产酸量(ECAR)都受到了显著抑制;并且P-S6的表达受到了明显的抑制,而P-AKT(ser473)没有受到影响。(3)NK细胞mTORC1活性抑制不依赖于p H、葡萄糖、氨基酸等肿瘤微环境的改变NKL细胞在Control-2、tumor两组培养基中P-S6受抑制的情况在pH纠正、添加葡萄糖、添加谷氨酰胺以及亮氨酸的条件下都没有改善。(4)线粒体的功能受损介导的ROS产生在肿瘤培养基抑制NK细胞mTORC1活性和功能中具有重要作用NKL细胞在Control-2、tumor两组培养基中培养后,线粒体膜电位TMRE明显下降,其数目显著增加;线粒体ROS(mitosox)和细胞ROS(DCF-DA)也显著增加。CYTO-ID试剂盒染色Control-2、tumor两组中NKL细胞的自噬受到抑制。活性氧清除剂NAC、GSH、mitoTempol把ROS清除后,Control-2、tumor两组处理过的NKL细胞的P-S6表达恢复且与Normal组无显著差异。ROS清除后,Control-2、tumor两组处理过的NKL细胞分泌IFN-γ的能力不再受到抑制,与Normal组无显著差异。研究结论:(1)肿瘤培养基模拟的体外肿瘤微环境显著抑制NK细胞分泌IFN-γ和直接细胞毒作用。(2)肿瘤培养基模拟的体外肿瘤微环境显著抑制NK细胞的代谢水平和mTORC1的活性。(3)NK细胞mTORC1活性抑制不依赖于p H、葡萄糖、氨基酸等肿瘤微环境的改变。(4)肿瘤培养基模拟的体外肿瘤微环境显著抑制NK细胞线粒体的功能及其自噬,继而导致ROS累积及氧化应激。(5)线粒体功能损伤介导的ROS增加是肿瘤培养基模拟的体外肿瘤微环境抑制NK细胞mTORC1活性和功能的重要因素。