动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种严重威胁人类健康的疾病,特别是心脑血管硬化,在发达国家属于死亡率最高的疾病。近年来,我国心脑血管硬化的发病率也逐年增加。目前,AS缺乏根治性的方法,临床以降低血脂,调节脂代谢为主要手段,效果并不理想。大量实验证明,氧化修饰在AS发病机制中占有重要地位,越来越受到人们的重视。动脉内膜处的LDL(low density lipoprotein, LDL)极易受到内膜细胞产生的氧自由基及代谢中间产物的影响,发生氧化形成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)。ox-LDL可通过多种途径损伤血管内皮,促进血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells, VSMC)的增殖和泡沫细胞的形成。因此,抑制ox-LDL的生成或降低ox-LDL对机体的损伤是预防AS发生发展的关键。中药多糖有很强的生物活性,可调控细胞分裂和分化,具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等药理作用,因此,中药多糖研究已成为生物化学领域中研究的热点之一。本实验主要探讨车前子多糖(plantain seed polysaccharide, PSP)对ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖的影响及其机制,为AS的防治提供进一步的理论依据。一大鼠主动脉平滑肌细胞的体外培养及其鉴定目的:探讨以简便、高效的方法获取VSMC,为相关研究提供实验材料。方法:(1) VSMC的原代培养:无菌条件下取出胸主动脉,立即置于含有D-Hank’s液的培养皿中,去除内膜和外膜,然后将中膜组织剪切成1 mm×1 mm大小的组织块贴于培养瓶底面。加入含20%胎牛血清的培养液,将培养瓶倒置于37℃、5%CO2培养箱中放置1~2 h,待组织块干涸并与瓶壁贴附,将培养瓶翻转继续静置培养3~5 d。(2) VSMC的传代培养:待原代培养的细胞达到80%融合时即可进行传代培养。加入胰蛋白酶消化,将培养瓶放于倒置显微镜下观察,待细胞回缩变圆翻转培养瓶,吸弃消化液,加入含20%胎牛血清的培养液终止消化,将细胞一分为二接种到新的培养瓶中继续培养。(3) VSMC的鉴定:①倒置显微镜观察培养细胞的形态、贴壁及生长情况。②抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法鉴定VSMC。结果:(1)原代细胞生长状况及形态学变化:原代培养4~7 d,少数组织块需继续培养至2~3周,可见到组织块周围有细胞游出。倒置显微镜下观察,细胞形态多样,呈梭形、三角形或不规则形。胞体较小,大小略有差异。(2)传代细胞生长状况及形态学变化:传代平滑肌细胞接种于培养瓶12 h后,细胞基本都已贴壁生长。培养1~2周左右,形态多呈梭形,并相互交织排列而呈现典型的“峰-谷”状生长。(3)抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法鉴定VSMC:经免疫细胞化学染色后,平滑肌细胞胞浆染成棕黄色,呈阳性反应,高倍镜下可见胞浆内大量棕黄色、与细胞长轴平行的纤维肌丝,即平滑肌α-肌动蛋白,核卵圆形居中,呈淡蓝色。结论:本实验采用组织贴块法成功地培养了VSMC,经光镜观察培养的主动脉VSMC具有平滑肌细胞特征,免疫组织化学染色鉴定进一步证实培养的细胞是VSMC。二车前子多糖对氧化型低密度脂蛋白诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响目的:探讨PSP对ox-LDL诱导的大鼠主动脉VSMC增殖的影响及其可能的作用机制。方法:以ox-LDL诱导大鼠主动脉VSMC体外增殖模型,利用细胞增殖抑制实验MTT法检测VSMC增殖程度。生化法测定细胞培养液中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性的变化。应用RT-PCR方法检测c-myc,MCP-1 mRNA的表达。观察不同浓度PSP对上述指标的影响。结果:(1) MTT实验结果表明,ox-LDL可诱导VSMC增殖,与空白对照组相比,差异有显著性(P<0.01),给予不同浓度的PSP后,低、中、高浓度的PSP组对平滑肌细胞增殖抑制率分别为(10.47±1.07)% , (26.75±2.36)% ,(47.68±2.53)%,并呈现一定的剂量依赖性。说明PSP对平滑肌细胞的增殖具有抑制作用。(2)脂质过氧化产物MDA含量的变化:ox-LDL可明显增加VSMC中MDA含量,空白对照组MDA含量为14.52±1.23 nmol/ml,ox-LDL组MDA含量为26.38±2.59 nmol/ml,与空白对照组相比有显著性差异(P<0.01)。不同浓度的PSP组MDA含量分别为24.19±2.63、21.97±1.49、19.85±1.78 nmol/ml,与ox-LDL组相比有显著性差异,并呈现一定的剂量依赖性。(3) SOD活性的变化:ox-LDL可明显降低细胞的SOD活力,与空白对照组相比差异有显著性(P<0.01)。空白对照组SOD活力为51.67±5.28 U/ml,ox-LDL组SOD活力为35.39±3.15 U/ml,不同浓度的PSP作用后其SOD活力分别为37.16±2.97、40.64±4.76、46.73±5.47 U/ml,可见PSP能增强SOD的活性。(4) NO含量的变化:ox-LDL可抑制NO的合成和释放,与空白对照组相比,ox-LDL组NO含量明显降低。空白对照组NO含量为78.65±6.76 nmol/ml,ox-LDL组NO含量为53.09±3.27 nmol/ml。低、中、高浓度PSP组NO含量分别为58.48±4.54、64.59±5.17、72.61±4.69 nmol/ml,与ox-LDL组相比有显著性差异(P<0.01)。说明PSP可以抑制ox-LDL的效应,增加NO含量。(5) NOS活性的变化:空白对照组NOS活性为1.56±0.25 U/ml,ox-LDL组NOS活性为1.18±0.11 U/ml,与空白对照组相比,ox-LDL组NOS活性明显降低。低、中、高浓度PSP组NOS活性均比ox-LDL组有所提高,分别为1.29±0.15、1.40±0.18、1.45±0.20 U/ml,与ox-LDL组相比差异有统计学意义(P<0.05),但各组之间无剂量依赖性。(6) VSMC中c-myc mRNA表达的变化:在空白对照组中,VSMC的c-myc mRNA呈现低表达,当加入ox-LDL作用48 h,c-myc mRNA相对表达量,呈现明显增高。分别加入不同剂量的PSP和ox-LDL共同孵育,PSP能明显抑制ox-LDL诱导的c-myc mRNA表达,不同浓度PSP组c-myc的相对表达量分别为0.309±0.037、0.286±0.044、0.245±0.038,PSP对c-myc mRNA表达的抑制作用随剂量增加而有增强趋势。(7) VSMC中MCP-1 mRNA表达的变化:在空白对照组中,VSMC的MCP-1 mRNA呈现低表达,当加入ox-LDL作用48 h后,MCP-1 mRNA相对表达量,呈现明显增高。预先2 h分别加入不同剂量的PSP和ox-LDL共同孵育,PSP能明显抑制ox-LDL诱导的MCP-1 mRNA表达,各个浓度的PSP组MCP-1的相对表达量分别为0.286±0.042、0.267±0.046、0.239±0.031,PSP对MCP-1 mRNA表达的抑制作用随剂量增加而有增强趋势。结论:(1) PSP对ox-LDL诱导的VSMC增殖有一定的抑制作用,对细胞的抑制率也随药物浓度增高明显增高。(2) PSP具有抗脂质过氧化和抗氧自由基损伤作用,减少脂质过氧化物MDA的生成,提高SOD的活性,这可能是其抑制ox-LDL诱导VSMC增殖的机制之一。(3) PSP可升高NO含量和NOS的活性,缓解ox-LDL对NO的抑制效应。(4) PSP对ox-LDL诱导的VSMC增殖的抑制作用可能与下调c-myc,MCP-1的表达有关。有关PSP抑制VSMC增殖的确切机制,还有待于今后深入地研究。