第一部分 Thy-1N肾组织和sublytic C5b-9刺激GMC上调的p300、Egr-1、ATF3和Gadd45基因表达时相及其与GMC凋亡的相关性目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠肾组织(体内)和体外亚溶解(sublytic)C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)中 p300、早期生长应答基因 1(early growth response gene 1,Egr-1)、活化转录因子 3(activating transcription factor 3,ATF3)及生长阻滞和 DNA 损伤诱导基因 45(growth arrest-and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)的基因表达情况,并探讨p300、Egr-1、ATF3和Gadd45在sublytic C5b-9诱导GMC凋亡中的作用。方法:复制大鼠Thy-1N模型,同时用sublytic C5b-9刺激体外培养的GMC,收集不同时间点和不同分组的肾组织或GMC,行qPCR和western blot(WB)检查p300、Egr-1、ATF3和Gadd45的表达水平,并分别用电镜和流式细胞术检查肾组织中GMC和体外培养GMC的凋亡情况。然后,构建Egr-1、ATF3和Gadd45 的过表达质粒(pIRES2/Egr-1、pIRES2/ATF3、pIRES2/Gadd45α、pIRES2/Gadd45β 和 pIRES2/Gadd45γ)和发卡状小干扰 RNA(short hairpin RNA,shRNA),即 shEgr-1、shATF3、shGadd45α、shGadd45β 和 shGadd45y 以及 p300的shRNA(shp300),将上述质粒分别转染至大鼠GMC中培养48h,过表达组不予处理,而shRNA组再给予sublytic C5b-9刺激3h,收集细胞用流式细胞术检测细胞凋亡百分比。结果:Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的大鼠GMC中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45的表达水平显著上调,其中Egr-1蛋白的高峰时间点在体内和体外分别为2h和1h,而p300、ATF3和Gadd45的高峰时间点在体内和体外均为3h。同时观察到发病大鼠的肾小球中GMC呈明显的凋亡改变,且被sublytic C5b-9刺激的GMC凋亡数量也明显增加。此外,过表达Egr-1、ATF3或Gadd45均能促进GMC凋亡,而沉默p300、Egr-1、ATF3或Gadd45则能显著抑制由sublytic C5b-9诱导的凋亡反应。结论:Thy-1N 大鼠肾组织和 sublytic C5b-9 刺激的 GMC 中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45的表达明显上调,且这些分子对sublytic C5b-9诱导的GMC凋亡有促进作用。第二部分 Sublytic C5b-9诱导GMC上调的Egr-1和ATF3之间的上下游关系及其对Gadd45β/γ基因表达的调控目的:检查由sublytic C5b-9诱导上调的Egr-1和ATF3之间的上下游关系,并探讨Egr-1和ATF3对Gadd45基因表达的调控作用与机制。方法:首先用qPCR和WB检查GMC转染pIRES2/Egr-1或shEgr-1后ATF3基因表达水平的变化,再用同样的方法检查GMC转染pIRES2/ATF3或shATF3后Egr-1基因表达水平的改变。接着,在GMC中共转染pIRES2/Egr-1+shATF3(设 shCTR 对照)或 shEgr-1+pIRES2/ATF3(设 pIRES2 对照),后者再予 sublytic C5b-9刺激3h,用流式细胞术检查GMC的凋亡情况。然后,用染色质步移(genome walking)方法获取大鼠ATF3基因近端启动子序列,并构建其启动子荧光素酶报告质粒pGL3-ATF3,将其分别与pIRES2/Egr-1和shEgr-1共转染至GMC，测定ATF3启动子的荧光素酶活性。此外,为研究Egr-1对ATF3转录后调控的机制,我们将shEgr-1转染至GMC后行sublytic C5b-9和蛋白酶体抑制剂MG132处理,用ATF3或泛素抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),检测ATF3的泛素化水平;另在shEgr-1转染GMC后行sublytic C5b-9刺激1h,再予放线菌素D(actinomycin D)处理的不同时间点,收集RNA用qPCR测定ATF3 mRNA的稳定性。同时,我们用qPCR和WB检查了 GMC在转染Egr-1和ATF3的过表达质粒或相应shRNA后Gadd45α/β/γ基因的表达水平。随后构建了 Gadd45α、Gadd45β 和 Gadd45γ 的启动子全长(full length,FL)荧光素酶报告质粒(pGL3-Gadd45α-FL、pGL3-Gadd45β-FL 和 pGL3-Gadd45γ-FL),并分别与Egr-1和ATF3的过表达质粒或shRNA共转染至GMC,检测Gadd45各基因启动子活性的变化。接着,根据TF search预测的Gadd45β和Gadd45γ启动子上Egr-1和ATF3的结合位点,我们又构建了 4个截短的Gadd45β启动子报告质粒(片段分别为-561～+236nt、-319～+236nt、-146～+236nt 和+23～+236nt)及3个截短的Gadd45γ启动子报告质粒(片段分别为-456～+72nt、-211～+72nt和-61～+72nt)。将上述Gadd45β和Gadd45γ的全长和截短启动子报告质粒分别与pIRES2/Egr-1或pIRES2/ATF3共转染GMC,再行荧光素酶活性检测以确定Egr-1和ATF3在Gadd45[3和Gadd45γ启动子上的结合区域。再者,通过染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验确证了 Egr-1和ATF3在Gadd45β和Gadd45γ启动子上的结合位点。同时,还用IP的方法检查了 sublytic C5b-9刺激GMC后不同时间点Egr-1和ATF3的结合情况。结果:过表达或沉默Egr-1基因可分别上调或下调GMC中ATF3的蛋白水平,而ATF3的mRNA未见显著变化。相反地,过表达或沉默ATF3基因后,GMC中Egr-1的基因表达并无明显改变。流式细胞术检查显示,shATF3处理细胞可显著降低由pIRES2/Egr-1导致的GMC凋亡增加,而pIRES2/ATF3能逆转shEgr-1所致的GMC凋亡减少。实验用genome walking技术获得了 ATF3近端启动子430bp序列,并成功构建了其启动子报告质粒。荧光素酶活性检测显示,过表达或沉默Egr-1对ATF3启动子活性并无显著影响。进一步从事转录后研究发现,MG132处理GMC可逆转shEgr-1所致的ATF3蛋白下降,但ATF3泛素化水平未见增加。用actinomycin D处理细胞后证实,沉默Egr-1后ATF3 mRNA降解加快。此外,过表达Egr-1或ATF3后均可上调Gadd45α/β/γmRNA和蛋白的表达以及启动子荧光素酶活性,而沉默Egr-1或ATF3后呈现出相反的作用。对于Gadd45β启动子,与全长Gadd45β启动子相比,截短启动子质粒(-146～+236nt和+23～+236nt)共转染pIRES2/Egr-1组以及截短启动子质粒(+23 to+236nt)共转染pIRES2/ATF3组,Gadd45β启动子活性显著下降,提示-319～-146nt和-146～+23nt两个区域可能含有Egr-1的结合元件,而-139～+23nt区域可能含有ATF3的结合位点。而就Gadd45γ启动子而言,相比于全长Gadd45γ启动子,截短启动子质粒(-211～+72nt和-61～+72nt)分别共转染pIRES2/Egr-1或pIRES2/ATF3后,Gadd45γ启动子活性均显著下降,提示-456～-211nt和-211～-61nt两个区域均含有Egr-1及ATF3的结合元件。进一步ChIP实验揭示,sublytic C5b-9能促进Egr-1和ATF3结合到Gadd45β启动子的-139～+115nt和-320～-110nt区域以及Gadd45γ启动子的-456～-211nt和-211—61nt区域。最后的IP实验表明,sublytic C5b-9刺激GMC后上调的Egr-1并未与升高的ATF3发生结合。结论:Sublytic C5b-9刺激GMC上调的Egr-1可通过促进ATF3 mRNA稳定性而发挥调控ATF3蛋白表达的作用。ATF3作为Egr-1的下游分子可以介导Egr-1的促凋亡作用。作为转录因子的Egr-1和ATF3均可与靶基因Gadd45β/γ启动子上的相应元件结合,进而促进了 Gadd45相应基因的转录与表达。第三部分p300乙酰化修饰ATF3在sublytic C5b-9诱导Gadd45β/γ基因表达及GMC凋亡中的作用目的:检查受sublytic C5b-9刺激的GMC中p300乙酰化修饰ATF3对Gadd45β/γ基因表达及GMC凋亡的影响。方法:首先用IP实验检查sublytic C5b-9刺激不同时间点和不同分组处理的GMC中p300与Egr-1和ATF3的结合情况以及Egr-1和ATF3的乙酰化水平。其次,为证实p300在ATF3乙酰化修饰中的作用,我们应用shp300、组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)活性抑制剂漆树酸(anacardic acid)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A,TS A)处理GMC,再给予sublytic C5b-9刺激,收集蛋白用ATF3抗体进行IP,并用WB检查ATF3的乙酰化水平。同时也行IP和WB实验检查sublytic C5b-9刺激GMC后3h,ATF3与CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)以及 p300/CBP 相关因子(p300/CBP associated factor，PCAF)的结合情况。此外,用质谱分析鉴定ATF3的乙酰化位点,并据位点构建FLAG标记的ATF3野生型(wild type,WT)质粒和乙酰化位点突变为精氨酸(R)的突变体。随后,将ATF3的WT质粒和突变体、shp300及各对照质粒分别转染GMC,再施以sublytic C5b-9刺激3h,行qPCR、WB和荧光素酶报告实验分别检查Gadd45β/γ的mRNA和蛋白水平及启动子活性的变化。然后将shATF3、shp300、ATF3(WT或突变体质粒)质粒分别转染GMC,在予sublytic C5b-9刺激后3h用ATF3抗体进行ChIP,并行PCR检测Gadd45β/y启动子上ATF3的结合情况。再者,收集sublytic C5b-9刺激3h的GMC样本,先用ATF3抗体进行ChIP,再用乙酰化赖氨酸(Ac-K)抗体进行染色质免疫耗竭(chromatin immunodepletion,ChID)或染色质免疫再沉淀(re-ChIP),测定不同乙酰化状态的ATF3在Gadd45β/γ启动子上的结合水平。另将shATF3和shCTR分别转染GMC,并予sublytic C5b-9刺激3h,依次用ATF3和p300进行ChIP和reChIP,再行PCR检测Gadd45β/γ启动子上p300的结合情况。除此之外,实验将shp300和shCTR分别转染GMC,给予sublytic C5b-9刺激Oh和3h,分别提取胞浆、胞核蛋白,应用WB实验检查ATF3蛋白定位。最后,行流式细胞术测定GMC在转染ATF3的WT和突变体质粒及对照质粒后细胞的凋亡百分率。结果:Sublytic C5b-9刺激GMC后上调的p300与ATF3可发生结合,且ATF3可被乙酰化修饰,此种结合水平和ATF3乙酰化水平均于3h达到高峰。与此同时,实验并未测到p300与Egr-1的结合以及Egr-1的乙酰化。另沉默p300或用anacardic acid抑制p300活性均可显著降低由sublytic C5b-9刺激GMC诱导的ATF3乙酰化水平。用TSA抑制去乙酰化酶活性后能明显增加ATF3的乙酰化水平,而沉默p300又能明显抑制TSA的效应。此外,IP实验证实,在sublytic C5b-9刺激后,仅测得ATF3与p300的结合,而未发现ATF3与CBP和PCAF的相互作用。应用质谱分析技术鉴定得到了 ATF3的一个乙酰化位点,即42位赖氨酸(K42)。据此构建的FLAG标记的ATF3 WT质粒和突变体分别命名为pIRES2-FLAG/ATF3(WT)和 pIRES2-FLAG/ATF3(K42R)o K42 突变后,ATF3的乙酰化水平显著下降。进一步的实验显示,shp300及pIRES2-FLAG/ATF3(K42R)处理GMC后不仅可以显著抑制GMC中Gadd45β/γ基因的表达水平和启动子活性,而且结合到Gadd45β/γ基因启动子上的ATF3也显著减少。此外,用Ac-K抗体耗竭所有乙酰化的ATF3后,ChID上清DNA中未能测到Gadd45β/γ启动子的相应片段,而用Ac-K抗体对ATF3 re-ChIP后,其沉淀中可查到Gadd45β/γ启动子的相应片段。另用p300抗体进行re-ChIP证实,沉默了ATF3基因后,几乎检测不到p300在Gadd45β/γ启动子上的结合。再者,对胞浆胞核中ATF3蛋白水平的测定表明,沉默p300后,由sublytic C5b-9上调的ATF3蛋白多见于细胞核内,与对照组相比,其在细胞内的分布未见显著变化。最后,用流式细胞术检查GMC凋亡发现,pIRES2-FLAG/ATF3(WT)转染GMC后可增加细胞凋亡量,而pIRES2-FLAG/ATF3(K42R)转染组,GMC凋亡数量未见明显上升。结论:Sublytic C5b-9刺激GMC后能促使上调的p300乙酰化修饰ATF3的第42位赖氨酸(K42),并增加ATF3调控Gadd45β/γ基因的转录活性。p300能与ATF3结合,并能以复合体的形式共同结合到Gadd45β/γ启动子上的ATF3结合元件,促进Gadd45β/γ基因的转录和表达,进而导致了 GMC的凋亡病变。