第一部分SALL4在鼻咽癌中的表达及其临床意义的研究目的:对鼻咽癌患者组织标本进行SALL4免疫组化染色(Immunohistochemistry,IHC),分析肿瘤组织中SALL4的表达水平与患者临床和病理基本信息之间的相关性。方法:调取华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科2015.1-2018.8期间鼻咽癌鼻咽组织活检存档蜡块,以及鼻息肉组织活检蜡块,重新制片,通过IHC方法检测肿瘤和非肿瘤组织中SALL4的表达情况,并对IHC染色结果进行评分,统计学分析组织中SALL4表达与患者年龄、性别、肿瘤分期和组织学类型等的相关性。结果:收集10例有可供检测组织的鼻息肉组织蜡块。131例鼻咽癌患者有可供检测的组织蜡块,并有完整的临床资料(包括但不限于:年龄、性别、TNM期和临床分期),活检前均未接受任何抗肿瘤治疗(手术、放疗、化疗或分子靶向治疗等)。鼻咽癌患者年龄16~74岁不等,年龄<60岁的患者约占79%。66%为男性患者,34%为女性患者,男女比例约为2:1。t检验显示,鼻咽癌患者组织标本的SALL4表达水平显著高于鼻息肉患者组织标本(5.80±0.284 vs.0?0,p<0.001)。在鼻咽癌患者中,T3-4期患者SALL4表达水平高于T1-2期患者(6.47±0.347 vs.4.53±0.441,p=0.001),临床分期III-IV患者SALL4表达水平高于I-II期患者(6.10±0.310 vs.4.05±0.575,p=0.011)。另外,χ~2检验结果显示,SALL4表达高低与患者的T分期相关,而与患者年龄、性别、N分期、M分期、临床分期和组织学类型均无关。T3-4期患者中SALL4高表达比例显著高于T1-2期患者(66.3 vs.46.7%,p=0.030)。结论:鼻咽癌患者组织中SALL4表达水平显著高于非肿瘤组织(鼻息肉),且SALL4高表达与患者较晚的T分期相关,可能是鼻咽癌患者的不良预后因素之一。第二部分SALL4和鼻咽癌细胞的上皮间质转化(EMT)和肿瘤干细胞表型(CSC)等生物学行为的关系研究目的:探索SALL4与鼻咽癌细胞上皮-间质转化(EMT)和肿瘤干细胞(CSC)之间的关系。方法:首先,构建鼻咽癌获得性放射抵抗细胞系CNE2R,通过慢病毒转染系统构建SALL4上调或者下调稳转细胞系,并采用显微镜观察并记录细胞的形态学变化;其次,鼻咽癌细胞迁移能力和侵袭能力分别采用划痕实验和Transwell实验来验证;之后,肿瘤干细胞成球实验和Cell Counting Kit-8(CCK8)实验分别用来检测鼻咽癌细胞的体外干细胞成球能力和体外增殖能力;最后,Western Blot蛋白免疫印迹实验验证SALL4表达水平与EMT、CSC相关分子标志物之间的关系。结果:成功构建鼻咽癌获得性放射抵抗细胞系CNE2R。在CNE2细胞中过表达SALL4后,CNE2-SALL4细胞间隙增宽、伪足形成,细胞呈明显EMT表型;划痕实验和Transwell实验证实,CNE2-SALL4细胞迁移和侵袭能力增强;肿瘤干细胞成球实验和细胞增殖实验提示,CNE2-SALL4细胞体外干细胞成球能力和体外增殖能力增强。而敲减SALL4后,CNE2-sh SALL4和CNE2R-sh SALL4细胞呈类圆形,细胞间隙正常,无伪足形成;细胞迁移和侵袭能力、干细胞成球能力和增殖能力均有所减弱。Western Blot实验证实,过表达SALL4导致CNE2-SALL4细胞E-cadherin表达减少、N-cadherin、Vimentin和CSC相关分子标志物表达增多(SOX2、OCT4、Nanog、ALDH以及Bmi1)。而下调SALL4后,CNE2-sh SALL4和CNE2R-sh SALL4细胞中,E-cadherin表达增多,N-cadherin、Vimentin和上述CSC相关分子标志物表达减少。结论:SALL4能够诱导鼻咽癌细胞产生EMT以及CSC。第三部分SALL4通过ATM/Chk2/p53信号通路调控鼻咽癌细胞放射抵抗的分子机制探讨目的:本部分研究旨在探讨SALL4与鼻咽癌细胞放射抵抗之间的关系及其潜在分子机制。方法:采用克隆形成实验验证不同鼻咽癌细胞系的放射敏感性变化。为进一步探索可能参与SALL4调控鼻咽癌放射敏感性的信号通路和作用机制,我们采用细胞爬片免疫荧光实验检测,接受射线照射后,不同鼻咽癌细胞系中γ-H2AX的表达情况。接着,流式细胞学分析用来检测细胞的凋亡比率和细胞周期分布情况;以及Western Blot蛋白免疫印迹实验用来检测相关蛋白在细胞中的表达情况,并对相应蛋白印记进行灰度值分析。最后,我们采用裸鼠皮下成瘤实验在体内水平验证SALL4对鼻咽癌细胞增殖、放射敏感性的影响。结果:首先,过表达SALL4后,CNE2-SALL4细胞的放射敏感性较对照组细胞明显降低,接受照射后,细胞克隆形成率显著升高;敲减SALL4后,CNE2-sh SALL4细胞和CNE2R-sh SALL4细胞的放射敏感性较对照组显著升高。接着,过表达SALL4使CNE2-SALL4细胞接受照射后出现γH2AX光点减弱、DNA损伤减少、细胞凋亡比例下降和G2/M期阻滞减少,同时CNE2-SALL4细胞中p-ATM、p-Chk2、p-p53和抗凋亡蛋白Bcl-2表达增多,而促凋亡蛋白表达cleaved caspase3和Bax减少。反之,敲减SALL4后,CNE2-sh SALL4细胞和CNE2R-sh SALL4细胞接受照射后,细胞DNA损伤、细胞凋亡和G2/M期阻滞增多,并且p-ATM、p-Chk2、p-p53和抗凋亡蛋白表达减少,而促凋亡蛋白表达增多。最后,CNE2-SALL4细胞裸鼠皮下成瘤体积增大,照射后肿瘤抑制率较对照组减少;而CNE2R-sh SALL4成瘤减小,照射后肿瘤抑制率较对照组增高。结论:SALL4能够通过调控ATM/Chk2/p53信号通路及其下游的凋亡相关蛋白表达来调控鼻咽癌细胞的放射敏感性。靶向SALL4治疗可能为临床放射抵抗鼻咽癌患者的治疗提供新的治疗思路和治疗策略。