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导致脊髓损伤后不可逆性截瘫的主要原因是脊髓继发性损伤（secondary injury），目前尚不清楚脊髓这种内源性自毁现象的发生机理，因此也无法阻断脊髓创伤后继发性损伤的病理进程。这是现代医学对脊髓损伤仍然缺乏有效治疗方法的重要原因。既往研究显示：脊髓创伤后缺血、氧自由基生成和脂质过氧化反应等多种因素均可以影响脊髓继发性损伤的进展。进一步的研究表明：脊髓细胞内外Ca2+离子失衡（内流）可以导致上述所有的病理现象，单纯的脊髓细胞外钙环境一个因素即可形成与脊髓损伤完全类似的病理变化，因此，钙离子内流在脊髓继发性损伤中的作用近来受到极大的重视。 现有的关于脊髓损伤分子生物学和基因学研究提示，脊髓继发性损伤不完全是脊髓组织被动遭受创伤损害的过程，在一定意义上，脊髓继发性损伤是神经细胞主动的程序性死亡过程（programmed cell death），它受到基因的严格调控。即时早期基因（immediate early genes IEGs）就是已被证实的参与中枢神经系统继发性损伤病理过程的一种可诱导基因，其家族成员包括c-fos（与之同根的FosB和Fra）、c-jun（与之同根的junB和junD）等，他们通过对靶基因的调控影响中枢神经系统继发性损伤的发生和中止。IEGs的表达主要受细胞内外环境(包括Ca2+、CaM及其依赖性激酶)的影响。那么，既往研究证实的钙离子内流影响脊髓继发性损伤是否通过其对IEGs等基因表达的诱导而起作用，目前国内外均缺乏研究。钙离子的跨膜内流是通过钙离子通道的激活而实现的。中枢神经系统的钙离子通道主要包括N—甲基—天冬氨酸受体和电压敏感性钙离子通道等，不同的钙离子通道定位于不同的亚细胞区域，可产生不同的生物学效应。如果能够证实该离子内流通过介导IEGs等基因的表达诱导脊髓继发性损伤的发生，那么，钙离子通过何种通道发挥作用有待于进一步研究。 钙离子进入细胞后，在CaM的介导下，通过Ca2+—CaM—激酶的酸化，可激活转录因子，发挥其生物学效应。那么，在脊髓继发性损伤中，Ca2+对IEGs第二军医大学中文摘要博士学位论文等基因表达的诱导是否需要CaM及其依赖性激酶介入，有必要进行更深入的探讨，以明确钙离子内流，钙调素激活，激酶活化到基因表达，引起脊髓继发性损伤的一系列病理过程和分子生物学机理，寻找阻断其病理进程的有效环节和脊髓损伤发生机制这一难题。在实践中，有利于寻找阻断脊髓继发性损伤的途径和方法，逐步实现对脊髓损伤的基因调控和基因治疗，从根本上改善脊髓损伤的治疗效果，对本学科的发展有现实意义。故此我们设计以下实验方法: 1.参考成熟大鼠海马脑片及Camline介绍的脊髓组织片离体培养技术，对大鼠脊髓组织片的培养技术根据实验条件进行改良，在不同培养时间对培养脊髓组织片进行常规HE，Nissl染色观察组织片大体结构，并利用州叮T技术进行组织活性鉴定。研究大鼠年龄、组织片厚度以及培养时间对组织活性的影响，探讨离体脊髓组织培养最合适的参数。 2.将离体脊髓组织片置于高钙离子环境，制作离体脊髓继发性损伤模型。 3.采用原位杂交方法，检测高钙离子、钙离子通道阻滞剂（APS和尼卡地平）、钙离子通道激动剂（Bayk8644）等因素干预下脊髓组织即早基因c一fos mRNA表达与时间的关系变化。探讨这些因素对脊髓离体组织c一fos mRNA表达的影响和作用。 4.采用原位杂交方法，检测高钙离子、钙调素阻滞剂（三氟啦嗦）、钙调素依赖性激酶抑制剂（KN一62）对离体脊髓组织即早基因c-fos mRNA的表达与时间的关系变化。探讨钙调素及其激酶在离体脊髓组织即早基因c一fos mRNA表达中的作用和地位。 通过以上实验研究，得出如下结论: 1.改良的脊髓组织片培养技术能使脊髓组织培养获得较为满意的组织成活率。脊髓组织片的组织活性受到取材鼠龄、组织切片厚度及培养时间的影响。本实验结果表明在长期离体脊髓组织片培养时，1一7d鼠龄的脊髓组织片培养1一14d时活性最高，但组织结构形态容易受到破坏，在培养超过14d组织活性急剧下降。7一14d鼠龄的脊髓组织片培养活性在培养14d后仍有较高的组织活性并能保持较好的组织形态结构。各年龄组Zoouln和300um左右厚度的脊髓组织片培养的活性最佳，明显较loouln和400uln厚度组高。 2.实验结果显示对照组、高钙离子组及阻滞剂/激动剂处理后，在脊髓组第二军医大学中文摘要博士学位论文织片灰质中c一fos基因均有不同程度地表达。高钙离子浓度组及Bayk8644溶液组，脊髓灰质神经元细胞中c一fos基因杂交信号在实验处理后3Omin至4h明显较对照组及钙离子通道阻滞剂组强。尤其以钙离子通道激动剂Bayk8644溶液组信号最为明显。（P<0.05）。高钙离子浓度组和钙离子通道激动剂Bayk8644溶液组处理后脊髓灰质前角神经元c一fos基因杂交信号在30分钟时间点时即有明显增加。但钙离子通道激动剂Bayk8644溶液组信号增强高峰出现较早，在2小时即达高峰，而高钙浓度组在4一6小时时间点才达高峰。各组c一fos基因杂交信号表达均在8小时左右开始恢复至对照组水平。各组c一fos基因杂交信号表达增强以高钙离子浓度组及