研究目的和背景：　　 结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一。转移是影响患者治疗效果和导致患者死亡的主要因为。阐明结直肠癌转移相关的分子机制及寻找预防和治疗的有效途径是目前结直肠癌研究的重要课题。　　 分子标签是以一定数量的基因作为一个整体,来判断或定义某些生物学特性。与单个的分子模式不同,分子标签以大量对单个基因的功能研究为基础,更加注重基因之间的共同协调作用,从整体和系统水平上对不同的生物学特性进行描述。　　 诱导性胚胎干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS cells),是将已分化的体细胞通过特定的基因组合与转染诱导重新编程使细胞回归到胚胎干细胞的状态,具有和胚胎干细胞类似的功能,能分化生成各种组织细胞。例如,在成人体细胞中导入4种基因(Oct4、Nanog、Sox2、Lin28或Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4),通过基因重新编程,使分化的细胞被逆转恢复到全能分化的状态。这些与iPS细胞诱导相关的基因称为iPS相关基因。　　 iPS相关基因与iPS之间的联系提示这些基因与干细胞存在密切联系,部分基因如c—Myc本身就是癌基因,本研究旨在以结直肠癌为模型探讨iPS相关基因在肿瘤发生、发展及其转移中的作用。我们首先应用结直肠癌的临床组织标本分析iPS相关基因的表达,并且我们应用独立的基因表达谱数据进一步分析iPS相关基因及iPS相关分子标签与结直肠癌临床病理特征的联系；在此基础上,我们应用逆转录病毒技术建立iPS相关基因稳定过表达的结直肠癌细胞亚克隆,探讨iPS相关基因的过表达对结直肠癌细胞相应的生物学特性的影响。　　 方法:　　 1、iPS基因及其相关分子标签的表达与结直肠癌患者临床病理特性之间的关系　　 应用68例临床结直肠癌组织标本,应用逆转录-荧光定量PCR技术分析Sox2、Oct4、Lin28、Lin28B及Klf2基因mRNA的表达及它们组成的分子标签的表达情况,并与患者的临床特征及Dukes分期进行相关性分析,初步确定Sox2、Oct4、Lin28、Lin28B及Klf2这些基因及组成的分子标签的表达与结直肠癌患者临床病理特性之间的关系。　　 应用独立的公共基因表达谱芯片数据进一步分析iPS相关基因与患者的临床特征及Dukes分期进行相关性,并进一步验证分子标签的可靠性和临床价值。通过免疫荧光技术确定部分iPS相关基因在临床结直肠癌组织细胞中的共表达情况。　　 2、iPS相关基因稳定过表达细胞亚系的建立与鉴定应用的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4过表达的逆转录病毒上清液感染SW480及SW620细胞,建立稳定过表达iPS相关基因的细胞亚系,应用Western blot分析相关细胞iPS基因在蛋白水平的表达,观察细胞亚系形态的变化。　　 3、iPS相关基因过表达对结直肠癌体外细胞生物学特性的影响应用干细胞球计数法、MTT、平板克隆、Transwell小室及划痕实验观察iPS相关基因稳定过表达细胞亚系细胞形态、增殖、细胞周期、侵袭及迁移能力的改变。　　 4、iPS相关基因过表达对结直肠癌细胞体内成瘤及转移的影响分别通过皮下成瘤和静脉注射两种方法比较不同的细胞亚系所建立的动物模型的不同。　　 5、统计学方法:应用SPSS13.0统计学软件,采用方差分析、相关分析、两个独立样本的T检验等统计学方法。　　 结果:　　 1、iPS基因及其相关分子标签的表达与结直肠癌患者临床病理特性之间的关系　　 应用68例临床结直肠癌标本,对Lin28B、Klf2、Oct4、Lin28、Nanog在结直肠癌组织与正常粘膜组织中mRNA水平的表达进行验证,检测这五种基因在患者肿瘤组织中的表达情况,并确定它们与患者的临床特性的联系。荧光定量PCR显示,Oct4、Lin28、Lin28B三个基因在肿瘤组中的表达明显高于正常粘膜组；Nanog、Klf2在肿瘤组的表达低于正常粘膜组,但在部分肿瘤进展比较晚期的患者它们的表达在肿瘤组中明显高于正常粘膜组。荧光定量的结果还显示,Lin28与肿瘤浸润深度有关,Lin28B与患者的淋巴结转移与否密切相关。　　 将Oct4、Lin28、Nanog、Klf2四个基因作为一个整体标签(LONK),与患者的临床特性进行相关性分析。结果表明,这一整体标签与患者临床Dukes分期有关。　　 应用独立的公共基因表达谱芯片数据,我们发现,Nanog与结直肠癌患者Dukes分期有关；Oct4与结直肠癌患者Dukes分期无关,但是对于处于DukesB期的患者,Oct4表达越高,其预后越差；Klf2与结直肠癌患者Dukes分期无关,但是对于处于Dukes C期的患者,Klf2表达越高,其预后越差；。LONK标签及由Sox2、Lin28、Oct4及Nanog组成的iPS标签与结直肠癌患者的临床Dukes分期及预后相关。　　 iPS相关基因Sox2与Lin28、Oct4与Nanog在临床结直肠癌组织标本中存在共表达。　　 2、iPS相关基因稳定过表达细胞亚系的建立与鉴定　　 应用多基因逆转录病毒体系感染结肠癌细胞SW480及SW620可成功建立稳定过表达的iPS相关基因的细胞亚系；Western blotting显示,在SW620细胞系中,过表达iPS的细胞系与母系相比,Sox2、Oct4、Lin28及Nanog的蛋白表达水平均上调。而在SW480细胞系中,过表达iPS的细胞系与母系相比,Sox2、Oct4、Lin28的蛋白表达水平均上调。与母系相比,稳定过表达iPS相关基因的SW480及SW620细胞变圆、伪足缩短、细胞倾向于成团生长。　　 3、iPS相关基因过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响　　 应用干细胞培养基DMEM F12进行培养,干细胞球计数结果显示:与对照组SW480/F12比,SW480/iPS/F12细胞形成干细胞球的数目较多(SW480组方差齐性,P=0.282；t=8.845,P=0.001)；与对照组SW620/F12比,SW620/iPS/F12细胞形成干细胞球的数目较多,差异均具有统计学意义(SW620组方差不齐,P=0.05:t=12.851,P=0.006)。　　 我们检测了iPS标签上调对常规培养条件或干细胞条件培养下SW4180及SW620细胞体外增殖能力、平板克隆形成能力、迁移及运动能力等的影响。　　 常规培养条件下,与对照组SW480比,SW480/iPS/细胞的增殖能力增高,差异具有统计学意义；干细胞条件培养下,与对照组SW480/F12比,SW480/iPS/F12细胞的增殖能力增高,差异不具有统计学意义。常规培养条件下,与对照组SW620比,SW620/iPS/细胞的增殖能力增高,差异具有统计学意义；干细胞条件培养下,与对照组SW620/F12相比,SW620/iPS/F12细胞的增殖能力增高,差异不具有统计学意义。　　 平板克隆形成实验显示,常规培养条件下,与对照组SW480比,SW480/iPS/细胞的克隆形成能力增强,差异具有统计学意义。常规培养条件下,与对照组SW620比,SW620/iPS/细胞的克隆形成能力增强,差异具有统计学意义；干细胞条件培养下,SW620/iPS/F12细胞的克隆形成能力增强,与对照组SW620/F12比较差异具有统计学意义。　　 划痕实验结果表明,常规培养条件下,与对照组SW480/1640细胞相比,SW480/iPS/1640细胞的迁移能力增强,差异具有统计学意义；常规培养条件下,与对照组SW620/1640相比,SW620/iPS/1640细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义。　　 运动小室实验证明,常规培养条件下,与对照组SW480比,SW480/iPS/细胞的运动能力增强,差异具有统计学意义；干细胞条件培养下,与对照组SW480/F12比,SW480/iPS/F12细胞的运动能力增强,差异具有统计学意义。常规培养条件下,与对照组SW620比,SW620/iPS/细胞的运动能力增强,差异具有统计学意义；干细胞条件培养下,SW620/iPS/F12细胞的运动能力增强,与对照组SW620/F12比较差异具有统计学意义。　　 4、iPS相关基因过表达对结直肠癌细胞体内成瘤及转移的影响　　 裸鼠皮下成瘤实验表明,SW620/iPS/1640在体内的生长能力比SW620/1640要强。两组细胞的成瘤能力差异具有统计学意义,不同时间点对细胞在裸鼠体内增殖的影响差异具有统计学意义。　　 瘤细胞裸鼠尾静脉注射实验显示,SW620/iPS/1640细胞在体内的转移能力比SW620/1640要强。　　 结论:　　 1、iPS相关基因可在结直肠癌组织中高表达或共表达,iPS部分基因及其相关分子标签与临床结直肠癌的进展和预后相关;　　 2、iPS基因上调可促进结直肠癌细胞的增殖、粘附、侵袭与迁移、干细胞球的形成等；iPS基因上调可促进结肠癌细胞在裸鼠体内的生长,并可促进结直肠癌的转移。