第一部分嗅鞘细胞的体外培养、纯化及鉴定目的：纯化培养和鉴定成年大鼠嗅球嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs),为后续实验做好准备。方法：取成年大鼠嗅球神经层,经酶消化的方法获得含有OECs的混合细胞悬液,采用多次长时差速贴壁的方法纯化OECs,用含有10%FBS的DF12培养基培养,2d后培养基中加入bFGF (20ng/ml)和forskolin(2uM)促进OECs的增殖,每隔3d半量更换培养基。倒置相差显微镜下观察OECs的生长状态,采用P75NTR和GFAP细胞免疫组化的方法鉴定OECs,荧光显微镜下观察OECs的形态并统计其纯度。结果：采用多次长时差速贴壁的方法能够去除绝大部分的污染细胞,包括成纤维细胞和星形胶质细胞,接种的OECs约24小时后贴壁,倒置相差显微镜下观察见大部分细胞胞体呈梭形、部分细胞胞体为多角形,伸出突起；细胞在接种培养的前2d生长缓慢,2d后培养基中加入bFGF (20ng/ml)和forskolin(2uM)可见细胞增殖加快,细胞突起细长,培养7d后见OECs覆盖皿底的90%,形成—细胞单层。P75NTR和GFAP染色见约92%的细胞为P75NTR(+),分布在突起、胞体,其中胞核被深染；约12%的细胞为GFAP (+)。结论：采用多次长时差速贴壁的方法能够获得实验所需纯度的OECs,培养基(DF12+10%FBS)中加入bFGF(20ng/ml)和forskolin(2uM)能够显著促进OECs的增殖。第二部分嗅鞘细胞对耳蜗螺旋神经节细胞离体培养的影响目的：探索在离体实验中OECs有无促进耳蜗听觉传入神经元—螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells SGCs)存活的作用。方法：取成年大鼠嗅球和新生大鼠蜗轴组织块进行OECs与SGCs的培养,采用多次长时差速贴壁的方法纯化培养OECs。实验分OECs与SGCs共培养组、SGCs在OECs条件培养液中(OEC-CM)培养组和SGCs单独培养组。倒置相差显微镜下观察OECs和SGCs生长状态,P75NTR免疫组化法鉴定OECs,神经元特异性标志物βⅢ-tubulin标记SGCs。结果：OECs贴壁培养7天后形成—细胞单层,在OECs与SGCs共培养体系中,SGCs在OECs形成的细胞单层的表面生长,并伸出长突起,呈现典型的双极神经元形态；在培养的前6d,随着培养时间的延长,SGCs较接种前减少,但共培养组中SGCs存活数量明显高于SGCs单独培养组(P<0.01)；与SGCs在OEC-CM中培养比较,共培养组更能促进SGCs存活,并且单独培养组的SGCs数量在培养的第6d出现大幅度减少；在培养的第9d,单独培养组中几乎没有SGCs生长；而在共培养组,SGCs的数量未见明显变化(P>0.05)；统计发现单独培养组中存活的SGCs由第3d的14.6±1.1SGCs/视野(×200)减少到第14d的3.3±0.3SGCs/视野；OEC-CM组中的SGCs由35.3±2.1SGCs/视野下降到12.9±0.3SGCs/视野；共培养组中存活的SGCs较其它组明显增多,由第3d的66.9±1.2SGCs/视野(×200)减少到第14d的38.9×1.0 SGCs/视野。结论：OECs与SGCs共培养能够促进新生大鼠SGCs存活。第三部分嗅鞘细胞促进螺旋神经节细胞存活的分子机制目的：初步研究OECs促进SGCs体外存活的分子机制。方法：建立OECs与SGCs共培养体系,实验分三组：共培养+脑源性神经营养因子(BDNF,500 pg/ml)组；共培养+BDNF抗体(IgY型,50 ug/ml)组；对照组为OECs与SGCs共培养。共培养3d后固定,βⅢ-tubulin免疫组化染色鉴定SGCs,每个培养皿随机取4个视野,荧光显微镜下统计βⅢ-tubulin标记的SGCs,统计各培养组中的SGCs。结果：共培养+BDNF组中有大量SGCs在OECs形成的单层细胞毯表面生长,但与对照组比较,SCG的数目无统计学差异；加入BDNF抗体(IgY)的共培养组中的SGCs数量明显减少(P<0.01)。结论：OECs与SGCs共培养中加入BDNF对SGCs存活无明显影响,而加入BDNF抗体(IgY)后存活的SGCs减少。OECs分泌BDNF可能是其促进SGCs体外培养的存活,发挥对SGCs的营养保护作用的分子机制之一。