1理论研究部分通过对现代医学研究进展及中医学对于肝纤维化研究概况的相关文献资料的整理分析,同时结合本课题组前期研究的基础上,进一步探讨“化瘀通络”法在防治肝纤维化中的具体机制,完善络病论治肝纤维化的理论研究。根据现代的解剖学知识,肝门静脉、肝动脉、肝静脉均有逐级分支,肝窦作为通透性最大的血窦之一,是肝内血管的终末分支,是保障血液和肝细胞间正常物质交换的组织学基础,具有参与物质交换、能量交换、信息传递的功能。而根据中医理论,络脉具有渗灌血气、互渗津血等独特的生理功能,是经脉中气血营养脏腑组织的桥梁和枢纽。因此,从肝窦和肝络的结构及功能特点来看,现代医学的肝窦及其在肝纤维化过程中发生的毛细血管化改变可归属于中医肝络及其病变的重要组成部分。2实验研究部分目的：动态观察芪术颗粒对CCL4所致的肝纤维化形成过程中VEGF介导的p38MAPK信号传导通路的影响,进一步阐释芪术颗粒抗肝纤维化的作用机理,完善从络病论治肝纤维化的理论,为“化瘀通络法”提供实验依据。方法：采用10%CC14橄榄油腹腔注射建立大鼠肝纤维化模型,同时给予芪术颗粒灌胃预防,并设立正常对照组、实验对照组、模型对照组,分别于造模的第1w、2w、4w时间点取大鼠肝组织进行以下观察。1：于预定时间点切取100mg(<1cm X1cm)新鲜肝组织置于-80℃的液氮中保存,用Western blot免疫印迹法检测大鼠肝脏组织中VEGF介导的总p38MAPK及p-p38MAPK、总ATF-2及p-ATF-2蛋白的表达量。2：取肝组织1mm3,迅速置于4℃2.5%的戊二醛固定。经过锇酸、梯度丙酮、环氧树脂及醋酸铀-柠檬酸铅等固定、包埋、染色。切片。透射电镜观察并照相,对肝窦窦壁结构、肝窦内皮窗孔数目、内皮下基底膜的形成进行动态观察。结果：1.大鼠肝组织总p38MAPK蛋白表达的影响各组大鼠肝组织在1周、2周和4周时间点,总p38MAPK的蛋白表达量均较强,显示较浓。1周时,模型对照组、芪术颗粒组与正常组比较有差异(1.75±0.25vs1.13±0.28,1.68±0.26vs1.13±0.28；p<0.05)；2周时,模型对照组、芪术颗粒组与正常组比较无差异(1.56±0.44vs1.22±0.26,1.38±0.24vs1.22±0.26；p>0.05)；4周时,模型对照组与正常组、实验组比较有显著差异(1.83±0.26vs1.28±0.21,1.83±0.26vs1.38±0.22；p<0.01).1周、2周时,模型组与芪术颗粒组之间无差异(1.75±0.25vs1.68±0.26；1.56±0.44vs1.38±0.24；p>0.05).4周时,模型对照组与芪术颗粒组之间有差异(1.83±0.26vs1.45±0.35；p<0.05)。正常对照组、实验对照组、模型对照组和芪术颗粒组大鼠肝组织总p38MAPK的蛋白表达量在1周、2周和4周时间点之间比较均无差异(1.13±0.28vsl.22±0.26vs1.28±0.21；1.10±0.26vs1.18±0.31vs1.38±0.22；1.75±0.25vs1.56±0.44vs1.83±0.26；1.68±0.26vs1.38±0-24vs1.45±0.35；p>0.05).2.芪术颗粒对大鼠肝组织p-p38MAPK蛋白表达的影响各组大鼠肝组织中在1周和2周两个时间点,p-p38MAPK蛋白微弱表达,显色极淡。在4周p-p38MAPK蛋白明显表达,显色较浓。1周时,模型对照组与正常对照组、实验对照组比较有差异(0.36±0.11vs0.21±0.07,0.36±0.11vs0.24±0.07；p<0.05).2周和4周时,模型对照组与正常对照组、实验对照组之间比较无差异(0.40±0.12vs0.28±0.12,0.40±0.12vs0.31±0.10,1.51±0.41vs1.15±0.22,1.51±0.41vsl.22±0.13；p>0.05),1周、2周和4周时三个时间点模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(0.36±0.11vs0.31±0.11,0.40±0.12Vs0.37±0.14,1.51±0.41vs1.32±0.45；p>0.05).实验对照组、正常对照组、模型对照组及芪术颗粒组大鼠肝组织p-p38MAPK的蛋白表达量在4周与1周、2周时间点之间均有显著差异(1.15±0.22vs0.21±0.07.1.15±0.22vs0.28±0.12；1.22±0.13vs0.24±0.07.1.22±0.13vs0.31±0.10；1.51±0.41vs0.36±0.11.1.51±0.41vs0.40±0.12,1.32±0.45vs0.31±0.11.1.32±0.45vs0.37±0.14,p<0.01).4组的1周与2周之间无差异(p>0.05)。3.芪术颗粒对大鼠肝组织总ATF-2蛋白表达的影响各组大鼠肝组织在1周和2周两个时间点,总ATF-2蛋白微弱表达,显色极淡。在4周大鼠肝组织中ATF-2蛋白明显表达,显色较浓。1周时,模型对照组、芪术颗粒组与正常对照组比较无差异(0.85±0.21vs0.61±0.14,0.81±0.33vs0.61±0.14；p>0.05),模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(0.85±0.21vs0.81±0.33,p>0.05).2周时,模型对照组与正常组、实验组比较有差异(1.29±0.28vs0.75±0.22,1.29±0.28vs0.92±0.35；p<0.05),模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(1.29±0.28vs1.13±0.26；p>0.05).4周时,模型对照组、芪术颗粒组与正常组比较有显著差异(1.51±0.26vs1.12±0.21,1.44±0.36vsl.12±0.21；p<0.01),模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(1.51±0.26vs1.44±0.36；p>0.05)。正常对照组大鼠肝组织总p38MAPK的蛋白表达量在4周与1周、2周时间点之间比较均有显著差异(1.12±0.21vs0.61±0.14,1.12±0.21vs0.75±0.22；p <0.01).芪术颗粒组和模型对照在1周和4周之间有显著差异(1.44±0.36vs0.81±0.33,1.51±0.26vs0.85±0.21；p<0.01).4.芪术颗粒对大鼠肝组织磷酸化ATF-2蛋白表达的影响各组大鼠肝组织在1、2周两个时间点,p-ATF-2蛋白微弱表达,显色极淡。在4周大鼠肝组织中ATF-2蛋白明显表达,显色较浓。1周时,模型对照组与正常对照组有显著差异(0.58±0.14vs0.38±0.14；p<0.01)、与实验对照组比较有差异(0.58±0.14vs0.38±0.04；p<0.05)。模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(0.58±0.14vs0.55±0.14；p>0.05)。2周时,模型对照组与正常对照组有显著差异(1.11±0.38vs0.62±0.13；p<0.01)、与实验对照组比较有差异(1.11±0.38vs0.71±0.25；p<0.05)；模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(1.11±0.38vs0.85±0.35；p>0.05)。4周时,模型对照组、芪术颗粒组与正常对照组、实验对照组比较均有差异(1.77±0.41vs1.13±0.38,1.77±0.41vs1.29±0.31；1.38±0.40vs1.13±0.38,1.38±0.40vs1.29±0.31；p<0.05),模型对照组与芪术颗粒组之间无差异(1.77±0.41Vs1.38±0.40；p>0.05)。实验对照组、正常对照组、模型对照组及芪术颗粒组大鼠肝组织p-ATF-2的蛋白表达量在4周与1周、2周时间点之间均有显著差异(1.13±0.38vs0.38±0.14,1.13±0.38vs0.62±0.13；1.29±9-31vs0.38±0.04,1.29±0.31vs0.71±0.25；1.77±0.41vs0.58±0.14,1.77±0.41vs1.11±0.38；1.38±0.40vs0.55±0.14,1.38±0.40vs0.85±0.35；p<0.01).实验对照组和模型对照组的1周与2周之间比较有差异(0.38±0.04vs0.71±0.25,0.58±0.14vs1.11±O.38；p<0.05).5.电镜观察结果正常对照组：大鼠肝细胞呈圆形或卵圆形,细胞界限清楚,细胞膜完整光滑,可见胆小管。胞质丰富,可见数量较多的圆形线粒体,嵴清晰,无肿胀。粗面内质网排列整齐,表面附着核糖体颗粒,高尔基复合体及大量散在的糖原颗粒。核膜清晰可见,完整连续,可见核仁。肝SEC有许多窗孔,在Disse Ⅰ间隙中,有丰富的肝细胞微绒毛及贮脂细胞。实验对照组：肝脏超微结构的改变与正常组基本相同。模型对照组：大鼠CCL4造模1周后,肝细胞胞浆内可见大小不等的脂质滴,部分肝细胞呈空泡状为内质网严重扩张所致,较多的圆形线粒体,嵴清晰,糖原颗粒较正常组少。Disse间隙中有丰富的肝细胞微绒毛,SEC有许多窗孔,外无基膜结构。2周时变化：模型组肝细胞轻度或重度损害,轻度损害者肝细胞胞浆内可见大小不等的脂质滴,糖原颗粒较正常组少。重度损害者肝细胞呈空泡状,为内质网严重扩张所致。Disse Ⅰ间隙中可见肝细胞微绒毛,SEC有较多窗孔,内皮细胞外无基膜结构,未见胶原纤维增生。4周时,模型组肝细胞胞浆内的脂滴融合呈大脂滴,将细胞核挤压,有核仁出现核固缩,内质网严重扩张致肝细胞呈空泡状改变,较多的线粒体内室扩张,基质变稀,电子密度明显下降,嵴变得短而少,移至边缘或发生断裂。较多成纤维细胞增生,旁有胶原纤维沉积。Disse间隙中可见肝细胞微绒毛,SEC窗孔较正常组明显减少,内皮细胞外无基膜结构。芪术颗粒组：大鼠1周时,肝细胞胞浆内亦可见大小不等的脂质滴,但较模型组少,未见肝细胞空泡状改变,可见数量较多的线粒体,嵴清晰,糖原颗粒较多。Disse腔中有丰富的肝细胞微绒毛,肝SEC有许多窗孔,但与模型组比较无明显差别,内皮细胞外无基膜结构；2周时,肝细胞出现轻度损害,胞浆内可见大小不等的脂质滴,但较模型组少,糖原颗粒较多。Disse腔中有丰富的肝细胞微绒毛,观察SEC窗孔与模型组无明显差别,无胶原纤维增生。4周时,肝细胞胞浆内可见大小不等的脂质滴,部分脂滴融合呈大脂滴,将细胞核挤压,未见肝细胞空泡状改变,少量线粒体电子密度明显下降,可见糖原颗粒,可见成纤维细胞,旁有胶原纤维增生。SEC窗孔较2周时减少,但所见窗孔多于模型组,内皮细胞外无基膜结构。结论：芪术颗粒可以调节p38MAPK信号通路,影响总p38MAPK及p-p38MAPK、总ATF-2及p-ATF-2蛋白的表达量,从而改善肝窦毛细血管化和保护肝细胞,逆转大鼠肝纤维化的进程。