论文部分内容阅读
21世纪以来,随着基因工程、显微注射、体细胞克隆、胚胎移植等相关技术的不断完善,转基因动物的生产得到了迅速的发展。2008年,我国启动了转基因动物新品种培育的重大专项,转基因动物的生产与培育取得了显著性的进展。目前,我国已经获得了多种转基因哺乳动物,本实验室于2011年也获得了我国首例胸腺素β4基因转基因克隆绒山羊。研究表明：胸腺素p4的过表达可以促进毛囊的生长和发育,而外源基因的拷贝数和整合位点与外源基因的表达有着密切的联系。因此,本实验选取产绒性能显著改善的转Tβ4基因绒山羊(NO.91和NO.28)和产绒性能未显著改善的转Tβ4基因绒山羊(NO.14和NO.94),分析外源基因的拷贝数与表达量之间的关系；再通过与体细胞克隆绒山羊(NO.81)的比较,研究Tβ4基因表达量与产绒量之间的内在联系,为转基因绒山羊的检测和转基因新品种的培育提供可靠的技术方法和理论依据。1)转基因绒山羊的阳性检测本实验首先采用Southern blot和PCR技术同时筛选转基因阳性绒山羊,然后再利用单一PCR技术对外源基因的多个位点进行鉴定。结果表明：四只转基因绒山羊全部为阳性,并且外源基因的多个位点(KAP6.1、Tβ4、CMV启动子、DsRed和新霉素抗性基因)都整合到转基因绒山羊的基因组中。2)外源基因拷贝数检测本实验以glucagon作为内标准基因,利用实时荧光定量PCR技术检测外源基因的拷贝数。绝对定量PCR的标准曲线为：log5N=-0.3794△Ct+0.8384(R2=0.9969)(△Ct为外源基因Ct与内标准基因Ct的差,N代表拷贝数),计算得到NO.28、NO.91、NO.14和NO.94原代转基因绒山羊中外源基因的拷贝数分别为2、4、6和1。3)Tβ4基因的相对表达量选取GAPDH作为内参,利用实时定量荧光PCR技术检测Tβ4基因mRNA的相对表达量,结果表明：内源基因GAPDH和目的基因Tβ4标准曲线的相关系数分别为0.999和0.997,扩增效率为0.97和0.96；与体细胞克隆绒山羊NO.81相比,NO.28.NO.91、NO.14和NO.94的mRNA的相对表达量分别为2.68、2.46、2.36和2.57倍；选取β-actin作为内参,利用western blot技术检测Tβ4基因蛋白质的相对表达量。western blot结果显示：与体细胞克隆绒山羊NO.81相比,NO.28、NO.91、KNO.14和NO.94的蛋白质相对表达量分别为1.384、1.380、1.166、0.982倍。4)Tβ4基因在毛囊中的表达量及绒毛比和产绒量分析采用石蜡切片和免疫组化技术分析毛囊中Tβ4基因的表达量,结果显示NO.28、NO.91、KNO.14和NO.94的毛囊中蛋白质的相对表达量是分别为体细胞克隆绒山羊NO.81的1.908、1.442、1.233、1.331倍。应用冰冻切片和HE染色来分析转基因绒山羊皮肤中的绒毛比,结果表明：NO.28、NO.91、NO.14、NO.94和NO.81的绒毛比分别为：14.167、14、12、10、11；产绒量分别为：1140、1150、805、680和740g。基于以上研究,我们得到转基因绒山羊毛囊中Tβ4的过表达可以促进绒的生长和发育,提高绒山羊的产绒量和毛囊中的绒毛比。