研究背景随着静脉溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术及冠状动脉搭桥手术等技术方法治疗急性心肌梗死的广泛开展,急性心肌梗死患者的预后得到明显改善。但是随之而来的心肌缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion,IR)却严重制约着上述方法的救治成功率,增加患者的住院时间、治疗费用并影响患者的预后。因此缺血再灌注损伤机制及心肌保护的研究一直是当今倍受重视的课题。缺血再灌注损伤所导致的最严重后果是细胞的死亡,以往认为坏死和凋亡是IR所诱导的细胞死亡的主要方式。近年来,一种新的程序性细胞死亡方式——自噬(Autophagy),即Ⅱ型程序性细胞死亡,越来越受到重视。适度的自噬是细胞完成自身代谢和细胞器更新的重要方式,对维持机体内环境稳定,以及调控细胞损伤和老化具有重要意义;而非生理性的、过度的自噬则会导致细胞过多死亡,从而引起组织器官产生病理性变化。自噬甚至可能影响细胞凋亡的发生,抑制自噬后缺血再灌注心肌细胞的凋亡比率也会明显减少。自噬在心肌缺血再灌注损伤的不同阶段扮演着不同角色,缺血期自噬轻度增加,具有一定的保护作用;但是在再灌注期自噬明显增加,反而加重心肌损伤。种种迹象表明,再灌注后心肌细胞自噬异常增多可能是导致心脏结构和功能损伤的重要启动因素之一。如果能够早期、有效抑制自噬的发生,有望减轻心肌缺血再灌注损伤,甚至减少细胞凋亡的发生。为了干预心肌缺血梗死及保护心肌,文献报道研究了许多药物如β-受体阻滞剂、自由基清除剂、钙拮抗剂等的心肌保护作用,近年来硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)在缺血再灌注损伤中的心肌保护作用的研究一直是一个热点。H2S被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的第三种具有生物活性的内源性气体信号分子。催化内源性H2S产生的酶具有组织特异性,其中胱硫醚γ裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)是心血管组织内唯一催化H2S生成的酶。在心血管组织中,蛋氨酸的代谢产物同型半胱氨酸在CSE的催化作用下与丝氨酸结合,生成胱硫醚,后者进一步分解生成内源性H2S。与其它公认的内源性气体信号分子NO和CO一样,H2S具有分子量小、持续产生、弥散迅速、作用广泛等特点。H2S在心脏生理状态及各种病理改变中发挥着重要作用,特别是近年来的功能性研究发现,H2S能够显著提高心肌细胞损伤后的存活率,减小心肌梗死面积,但其对心肌细胞自噬的影响目前文献报道较少。研究目的本实验以体外培养乳鼠心肌细胞及在体大鼠心肌为实验研究和观察对象,建立缺血再灌注损伤的离体和在体模型,并以外源性硫化氢的供体——硫氢化钠(NaHS)进行干预。观察各组心肌细胞活力改变,心肌梗死面积、LDH释放量,从而评价各组心肌组织和细胞的受损程度;MDC荧光染色、流式细胞仪检测各组心肌细胞自噬率;并通过RT-PCR和Western-blot方法检测细胞和心肌组织的自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)的mRNA和蛋白表达水平,从细胞和分子水平探讨硫化氢对缺血再灌注损伤中心肌细胞自噬的影响,并通过给予Akt抑制剂,进一步探讨PI3K/Akt信号通路在H2S抑制缺血再灌注损伤心肌细胞自噬中的作用,为临床围手术期心肌保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。研究方法和结果本实验主要分为四个部分,主要方法和结果如下一、心肌缺血再灌注损伤模型的制备(一)离体心肌细胞缺氧复氧(hypoxia reoxygenation, HR)损伤模型的建立1、缺氧复氧损伤模型的建立细胞培养成功后,利用HR模型,模拟心肌缺血再灌注损伤。即对心肌细胞以低氧培养24h模拟缺血,恢复氧供2h模拟再灌注,利用细胞培养液的变化(缺氧、乳酸堆积、酸中毒,再灌注后恢复正常)模拟缺血再灌注损伤。2、缺氧复氧损伤模型有效性验证实验分为2组,即正常对照组和HR组。通过MTT法检测心肌细胞的活力,全自动生化分析仪检测培养清LDH释放量,验证离体心肌细胞缺血再灌注损伤的有效性。缺血再灌注组心肌细胞活力为对照组的61.45±3.85%(P<0.05),其LDH明显高于对照组(P<0.05)。说明本方法建立的离体心肌细胞缺血再灌注损伤是有效、可行的。(二)在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立1、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立方法成年SD大鼠结扎左前降支(left anterior descending artery, LAD) 30 min模拟心肌缺血后,松线恢复灌注120min。成功标准:结扎LAD后心电图Ⅱ导联ST段出现弓背向上抬高,T波高耸等为缺血成功,放松结扎线后,抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功。2、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的鉴定实验分为2组,即正常对照组和IR组。通过TTC染色测定各组大鼠心肌梗死面积、全自动生化分析仪检测血清LDH释放量等方法验证在体IR的心肌损伤作用。结果发现IR组心肌梗死面积明显高于对照组(P<0.05);IR组大鼠血清LDH明显高于对照组(P<0.05)。进一步观察心肌力学发现IR组大鼠心肌±dp/dtmax明显低于对照组(P<0.05)。说明本方法建立的在体心肌缺血再灌注损伤模型成功。二、H2S通过抑制心肌细胞自噬减轻心肌缺血再灌注损伤(一)离体水平1、实验分组:培养72h的乳鼠心肌细胞随机分为6组正常对照组(A组):含10%胎牛血清DMEM培养基(37℃,5%CO2、95%空气)培养26.5h;HR模型组(B组):不含血清的DMEM培养基,正常培养(37℃,5%CO2、95%空气)30min后,三气培养箱(92% N2、3%O2、5% CO2)中培养24h,然后37℃、5%CO2、95%空气培养箱中培养2h;10uM NaHS预处理组(C组):含10uM NaHS,不含血清的低糖DMEM培养基孵育30min后,模拟体外缺血再灌注(同组B);30uM NaHS预处理组(D组):含30uM NaHS,不含血清的低糖DMEM培养基孵育30min后,模拟体外缺血再灌注(同组B);50uM NaHS预处理组(E组):含50uM NaHS,不含血清的低糖DMEM培养基孵育30min后,模拟体外缺血再灌注(同组B); 100uM NaHS预处理组(F组):含100uM NaHS,不含血清的低糖DMEM培养基孵育30min后,模拟体外缺血再灌注(同组B);2、针对细胞自噬的特征应用流式细胞仪检测心肌细胞自噬率各组细胞处理后,50uM MDC荧光染色标记自噬细胞,以流式细胞仪进行自噬细胞定量检测,灵敏度高。检测结果如下:B(HR)组检出较多自噬细胞,明显高于其他各组(P<0.05);D组心肌细胞自噬率明显低于C、E、F组(P<0.05),与A组无明显差异(P>0.05),说明缺血再灌注损伤后心肌细胞自噬率明显增高,而外源性H2S能够抑制IR诱导的心肌细胞自噬,并具有浓度依赖性。3、心肌细胞损伤程度检测(1)MTT法检测心肌细胞活力各组心肌细胞处理后,应用MTT法检测各组心肌细胞活力。结果显示:B组心肌细胞活力仅为对照组的61.45±3.85%(P<0.05),C、D、E、F组细胞的活力均明显高于B组(P<0.05);尤以D和E组明显高于C和F组(P<0.05)。(2)乳酸脱氢酶漏出量测定留取各组细胞处理后培养上清,HITACH全自动生化分析仪检测。乳酸脱氢酶漏出量可以间接反映心肌细胞损伤情况,结果:B、C、D、E、F组中LDH漏出量明显高于A组(P<0.05);D、E组心肌细胞LDH漏出量低于B组(P<0.05)。表明IR造成离体心肌细胞损伤,而H2S能够抑制IR诱导的心肌细胞损伤,并具有浓度依赖性,尤以30uM的浓度最佳。(二)在体水平1、实验分组:成年SD大鼠随机分为5组正常对照组(A组):成年SD大鼠,开胸后仅于心肌表面穿过缝线,并不结扎LAD,30min后关胸,120min后开胸取左室前壁心肌组织及血清;缺血再灌注模型组(B组):成年SD大鼠,腹腔注射生理盐水0.5ml,30min后结扎LAD30min,松线再灌注120min后开胸取左室前壁心肌组织和血清;10uM/kg NaHS预处理组(C组):结扎LAD前30min,给予10uM/kg NaHS腹腔注射(0.5ml),余同B组;30uM/kg NaHS预处理组(D组):结扎LAD前30min,给予30uM/kg NaHS腹腔注射(0.5ml),余同B组;100uM/kg NaHS预处理组(E组):结扎LAD前30min,给予100uM/kg NaHS腹腔注射(0.5ml),余同B组。2、心肌损伤程度检测(1)TTC染色比较各组心肌梗死面积各组心肌细胞处理后,应用伊文氏蓝和TTC双染色法比较各组大鼠心肌梗死面积(梗死面积/危险区面积)。结果发现:B组心肌梗死面积明显高于对照的A组(P<0.05),D组梗死面积明显低于B组(P<0.05)。(2)乳酸脱氢酶漏出量测定留取各组大鼠血清,全自动生化分析仪检测。结果: B、C、E组血清中LDH漏出量明显高于A组(P<0.05);D组心肌细胞LDH漏出量低于B组(P<0.05)。(3)大鼠心肌力学检测各组大鼠均给予小动物心肺功能监测仪,经颈动脉插管实时监测大鼠心肌±dp/dt变化。结果发现:B组大鼠心肌±dp/dtmax明显低于对照的A组(P<0.05);D组大鼠心肌±dp/dt(Max)明显高于B组。表明IR造成在体心肌细胞损伤、影响心功能,而H2S能够抑制IR诱导的心肌损伤,并具有浓度依赖性,尤以30uM/kg的浓度最佳。三、H2S抑制心肌细胞自噬相关基因表达的研究(一)实验分组:同第二部分(二)外源性H2S对心肌细胞Beclin1的mRNA表达的影响1、离体水平收集各组处理后的细胞,采用RT-PCR方法定量检测各组心肌细胞Beclin1的mRNA表达量。结果:B组细胞Beclin1的mRNA相对表达量明显高于对照组,达到A组的2.41±0.86倍(P<0.05),D组、E组Beclin1的mRNA表达量明显低于B组(P<0.05)。2、在体水平收集各组处理后的心肌组织。采用RT-PCR方法定量检测各组心肌细胞Beclin1的mRNA表达量。结果:B组心肌Beclin1的mRNA相对表达量明显高于对照组,达到A组的1.83±0.61倍(P<0.05),D组心肌的表达量为对照组的1.05±0.31倍,明显低于B组(P<0.05);而C、E组心肌的表达量分别为对照组的1.43±0.44倍和1.66±1.21倍,与B组无明显差异(P>0.05),明显高于D组(P<0.05)。说明H2S可以抑制Beclin1的表达,并具有浓度依赖性,过高浓度的H2S反而丧失其抑制心肌细胞自噬作用。(三)外源性H2S对心肌细胞Atg5的mRNA表达的影响1、离体水平收集各组处理后的细胞,采用RT-PCR方法定量检测各组心肌Atg5的mRNA表达量。结果:B组细胞Atg5的mRNA相对表达量明显高于对照组,达到A组的1.85±0.41倍(P<0.05),D、E组细胞的表达量分别为对照组的1.09±0.73倍和1.03±0.46倍,明显低于B组(P<0.05)。2、在体水平收集各组处理后的心肌组织。采用RT-PCR方法定量检测各组心肌Atg5的mRNA表达量。结果:B组心肌Atg5的mRNA相对表达量明显高于对照组,达到A组的2.63±0.29倍(P<0.05),D组心肌的表达量为对照组的1.18±0.34倍,明显低于B组(P<0.05);而C、E组心肌的表达量分别为对照组的2.33±1.72倍和2.18±0.99倍,与B组无显著差异。表明H2S可以抑制Atg5的表达,并具有浓度依赖性,过低或过高浓度的H2S并不能抑制Atg5的表达。(四)外源性H2S对心肌细胞LC3蛋白表达的影响1、离体水平收集各组处理后的细胞,采用Western-blot方法定量检测各组心肌细胞LC3蛋白的表达量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值观察H2S对LC3蛋白表达的影响。结果:B、C、D、E、F组细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值为2.21±0.55、1.68±0.30、1.05±0.26、1.19±0.28、1.74±0.26,明显高于正常对照组的0.44±0.23(P<0.05);其中C、D、E组细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显低于B组(P<0.05),尤以D、E组比值最低,二者之间无明显差异。2、在体水平收集各组处理后的心肌组织,采用Western-blot方法定量检测各组心肌LC3蛋白的表达量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值观察H2S对LC3蛋白表达的影响。结果:B组心肌的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值为2.76±0.25,明显高于正常对照组的1.43±0.3(P<0.05),D组心肌的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值为1.54±0.20,明显低于B组(P<0.05)。表明H2S可以抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达,并具有浓度依赖性。四、PI3K/Akt信号通路在H2S抑制心肌细胞自噬中的作用(一)实验分组:HR组(A组):不含血清的DMEM培养基,三气培养箱(92% N2、3%O2、5% CO2)中培养24h后,37℃、5%CO2、95%空气培养箱中培养3h;30uM NaHS预处理组(B组):不含血清的低糖DMEM培养基加入终浓度30uM NaHS,30min后建立HR模型,模拟体外缺血再灌注(同组A);Tricribine处理组(C组):不含血清的低糖DMEM培养基加入终浓度1uM tricribine,30min后同A组;Tricribine+NaHS处理组(D组):不含血清的低糖DMEM培养基加入终浓度1uM tricribine,30min后同B组;(二)PI3K/Akt信号通路在H2S抑制心肌细胞Beclin1 mRNA表达中的作用收集各组处理后的细胞,采用RT-PCR方法定量检测各组心肌细胞Beclin1的mRNA表达量。结果:B组细胞Beclin1的mRNA表达量明显低于A组,达到A组的0.43±0.13倍(P<0.05),C组、D组Beclin1的mRNA表达量为A组的0.92±0.09倍和0.69±0.07倍,明显高于B组(P<0.05)。表明H2S抑制心肌细胞Beclin1 mRNA表达的作用是通过或部分通过PI3K/Akt信号通路实现的。(三)PI3K/Akt信号通路在H2S抑制心肌细胞Atg5 mRNA表达中的作用收集各组处理后的细胞,采用RT-PCR方法定量检测各组心肌细胞Beclin1的mRNA表达量。结果:B组细胞Atg5的mRNA表达量明显低于A组,达到A组的0.5±0.12倍(P<0.05),C组、D组Atg5的mRNA表达量为A组的1.08±0.16倍和0.77±0.13倍,明显高于B组(P<0.05)。表明H2S抑制心肌细胞Atg5 mRNA表达的作用是通过或部分通过PI3K/Akt信号通路实现的。(四)PI3K/Akt信号通路在H2S抑制心肌细胞LC3-Ⅱ蛋白表达中的作用收集各组处理后的心肌组织,采用Western-blot方法定量检测各组心肌LC3蛋白的表达量。结果:B组心肌的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值为0.72±0.4,明显低于对照的单纯IR组的2.1±0.32(P<0.05),C、D组心肌的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值分别为2.22±0.64和1.5±0.38,明显高于B组(P<0.05)。表明H2S抑制心肌细胞LC3-Ⅱ蛋白表达的作用是部分通过PI3K/Akt信号通路实现的。主要结论本研究应用体外培养乳鼠心肌细胞及成年SD大鼠,成功建立缺血再灌注损伤的离体和在体模型,以外源性H2S进行干预。观察H2S对缺血再灌注心肌自噬及自噬相关基因表达的影响,以阐明H2S通过抑制自噬减轻心肌细胞缺血再灌注损伤及其分子机制。主要结论如下:1、应用三气培养箱进行缺氧复氧培养及结扎和松解LAD的方法模拟离体和在体缺血再灌注损伤可达到满意效果。2、外源性H2S通过抑制自噬减轻心肌缺血再灌注损伤,并具有浓度依赖性。3、外源性H2S通过抑制自噬相关基因Atg5、Beclin1的mRNA表达和LC3-Ⅱ蛋白表达,发挥其抑制心肌细胞自噬作用。4、PI3K/Akt信号通路参与H2S抑制心肌细胞自噬的信号转导过程。