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植原体是一类无细胞壁的原核生物,属于原核生物界(Procaiyotae)柔膜菌纲(Mollicutes),专性寄生于植物韧皮部的筛管细胞中,主要靠吸食植物韧皮部汁液的叶蝉、飞虱等昆虫介体传播。由于植原体难以在无细胞介质中进行人工培养,不能依靠传统上用于微生物分类的表型特征进行鉴定,故其分类便不可避免地依靠分子生物学手段。目前国际上植原体的分类主要依靠其高度保守的16S rRNA基因,尤其是Lee等基于聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA序列并进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析构建了第一个全面的植原体分类方案,为植原体分类提供了可靠方法。经过定期的更新和修订,这个以16S rDNA的PCR-RFLP分析为基础的分类系统已被广泛接受并用于对植原体菌株进行分类。本研究利用分子生物学手段和电子显微镜技术对4种疑似植原体病害的病原种类进行了分子检测与鉴定。在山东青岛发现了疑似植原体侵染的表现黄化症状的牡丹(Paeonia suffruticosais)植株,在透射电子显微镜下观察到感病牡丹的韧皮部筛管细胞中存在典型的植原体。然后使用通用引物P1/P7(直接PCR引物)以及R16F2n/R16R2(巢式PCR引物)克隆其16S rRNA基因对该植原体进行分子鉴定,并对其进行序列分析、系统进化分析以及RFLP分析,结果表明,引起牡丹黄化病的病原为植原体(Tree peony yellows phytoplasma,简称TPY),能够划分到暂定种’Candidatus. phytoplasma solani’,且该植原体属于16SrXII组(stolbur组),并且代表16SrXII组的一个新亚组(16SrXII-H)。之后我们克隆了该植原体的核糖体蛋白(rp)基因以及延伸因子(tuf基因,序列分析以及系统进化分析结果与16S rRNA基因的分析结果一致,进一步证实了该植原体的分类地位。这是世界范围内关于植原体感染牡丹的首次报道。从山东泰安采集到表现黄化症状的乌桕(Sapium sebiferum)枝条及叶片样品,在透射电子显微镜下观察到感病乌桕的韧皮部筛管细胞中存在植原体。之后以表现黄化症状的乌桕韧皮部总DNA为模板使用通用直接引物P1/P7以及巢式引物R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增其16S rRNA基因片段,并使用rp基因引物rpL2F3/rp(I)R1A以及rp(III)-FN/rp(I)R1A进行半巢式PCR扩增其rp基因。基于16S rRNA基因以及rp基因进行序列分析以及系统进化分析,结果表明与乌桕黄化病相关的病原为植原体,且属于16SrⅢ组(X-病组)。然后我们利用pDRAW32软件以及iphyClassifier在线软件对其16SrRNA基因F2n/R2区段进行模拟RFLP分析,发现CTTY的RFLP图谱与现存的16SrⅢ组的各亚组成员均不一致,且相似系数≤0.97。之后经过实际的RFLP验证,结果与虚拟分析的结果一致,因此乌桕黄化植原体(Chinese tallow tree yellows phytoplasma,将其简称CTTY)代表16Sr Ⅲ组中的一个新亚组(16Sr Ⅲ-Y)。本研究在世界范围内首次确定乌桕为16SrⅢ组植原体的新寄主。在山东泰安发现了表现黄化症状的茶花(Camellia japonica)植株。透射电镜观察结果显示感病的茶花植株韧皮部筛管细胞中存在植原体。通过使用植原体通用引物P1/P7以及R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增其16S rRNA基因片段,并且对16S rRNA基因F2n/R2区段进行RFLP分析,结果显示引起茶花黄化病的病原为植原体,属于榆树黄化组(16SrV),并且能够划分到16SrV-B。对其rp基因序列分析后发现,其rp基因序列与rpV-C亚组的一致率最高。因此,茶花黄化植原体(Camellia yellows phytoplasma,将其简称CY),为16SrV-B (rpV-C)亚组成员,这是世界范围内关于植原体感染茶花的首次报道。疑似植原体侵染的表现黄化症状的三角梅(Bougainvillea sp.)植株在山东泰安被发现。利用植原体16S rRNA基因通用引物P1/P7以及R16F2n/R16R2从表现黄化症状的三角梅总DNA中扩增得到了1244bp的特异性片段。序列分析结果表明,三角梅黄化植原体(paper flower yellows phytoplasma,简称PFY)属于16SrXII组(stolbur组,暂定种’Ca. phytoplasma solani’)。 RFLP分析结果表明PFY的RFLP图谱与16SrXII-A亚组植原体一致,证明引起三角梅黄化病的植原体属于16SrXII-A亚组。并且通过对该植原体rp基因(1253bp)、tuf基因(946bp)的序列分析和系统进化分析使上述结果得到进一步证实。这是世界范围内关于植原体感染三角梅的首次报道。本研究中的牡丹黄化植原体、乌桕黄化植原体、茶花黄化植原体以及三角梅黄化植原体均为国内外首次报道。