肾脏纤维化是肾脏受到创伤、感染、炎症、血循环障碍,以及免疫反应等多种致病因素刺激后,其固有细胞受损,发展到后期出现大量胶原沉积和积聚,造成肾实质逐渐硬化,形成瘢痕,直至肾脏完全丧失脏器功能的病理生理过程。无论是原发性肾小球疾病,还是糖尿病、输尿管梗阻导致的肾功能损伤都与肾脏纤维化病变的程度密切相关。因此,肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）共同的病理特征,是终末期肾功能衰竭形成的重要原因。肾脏纤维化包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,本质上以细胞外基质的过度积聚和沉积为主要特征。目前认为上皮间质转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是导致肾间质纤维化的重要原因。EMT过程是指肾小管上皮细胞在一系列刺激因素的作用下,转化形成成纤维细胞,随后成纤维细胞增殖并产生过多的细胞外基质在肾组织沉积,最后引起肾小管缺失。肾小管上皮细胞发生EMT时,细胞变得细长并失去黏附性和极性;同时,细胞表达上皮标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞角蛋白（cytokeratin）及紧密黏连蛋白-1（zonula occludens 1,ZO-1）减少,而间充质标志蛋白波形蛋白（vimentin）、a-SMA、钙结合蛋白S100A4、纤连蛋白（fibronectin,FN）、成纤维细胞特异蛋白-1（fibroblast-specific protein 1,FSP-1）及I、IV型胶原蛋白表达增加。转化生长因子β1（transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）是诱导EMT的最强和最常见的刺激因子,其主要通过smad依赖性信号途径介导EMT。TGF-β1通过结合和激活跨膜丝/苏氨酸I型和II型受体,促进smad2与smad3磷酸化。磷酸化的smad2/3与smad4形成异聚体复合物,转移进入细胞核调控相关基因的转录,进而诱导肾小管上皮细胞EMT,促进肾脏纤维化的形成。因此,深入研究肾小管上皮细胞的EMT过程及调控机制对防治肾脏纤维化具有重要意义。钙离子(Ca²⁺)是细胞信号传导过程中重要的第二信使,细胞内Ca²⁺稳态对维持细胞的正常生理功能起至关重要的作用,而Ca²⁺稳态的失衡与肾脏疾病密切相关。早期研究发现,在肾脏纤维化的发展过程中,无论是在体肾脏组织还是离体成纤维细胞、足细胞和肾小管上皮细胞,钙通道表达或者胞内Ca²⁺水平都有明显增加,揭示细胞内Ca²⁺调控异常参与肾脏纤维化的发生发展过程,钙通道可能是防治肾脏纤维化的有效靶点。细胞膜上的钙离子通道是调控细胞内Ca²⁺水平的主要途径。钙通道按其功能和特性可分为三大类:电压依赖性钙通(voltage-dependent Ca²⁺channel,VDCC)、受体操纵性钙通道（receptor-operated calcium channel,ROCC）和钙池操纵性钙通道(store-operated Ca²⁺channel,SOCC)。其中VDCC主要表达于心肌细胞和神经细胞等兴奋性细胞中,参与神经递质的释放、平滑肌收缩、心脏起搏等生理功能。ROCC和SOCC则在兴奋性和非兴奋性细胞中均有表达,是介导非兴奋细胞Ca²⁺内流的主要通道。以往研究发现肾小球系膜细胞、成纤维细胞和足细胞中均有ROCC和SOCC的表达,并参与了细胞增殖、迁移、收缩、基质生成等生理功能。近年来的研究表明Orai1与基质交互分子1（stromal interaction molecular1,Stim1）共同构成了SOCC的分子基础。Orai1是一种细胞膜蛋白,含有四个跨膜区（TM1-TM4）,构成可以通过Ca²⁺的孔道通道。Stim1分布在内质网上,作为Ca²⁺浓度感受器。在钙池充盈的情况下,Stim1均匀分布于内质网膜上处于稳定状态。当细胞受到外界刺激引起钙池耗竭时,Stim1和Orai1同时向内质网-细胞膜最接近的地方移动并相互结合。此时,Orai1的孔道开放引起胞外Ca²⁺进入细胞内。这一过程被认为是SOCC的激活机制。最近,有关Orai1通道在肾功能调控和肾脏疾病中的作用已引起关注。前期研究发现Orai1钙通道异常可能是肾小球疾病、慢性肾病和肾脏肿瘤发生的重要机制,而且Orai1钙通道在肾小球系膜细胞的增殖和基质形成、肾纤维母细胞转分化和肾透明细胞癌细胞增殖迁移等过程中均发挥了重要作用。但Orai1钙通道在肾小管上皮细胞的功能调控,特别在肾脏纤维化过程中作用,尚不清楚。Endophilin是一类富集吡咯氨酸SH3结构域的蛋白家族,而Endophilin A2是其中一类广泛分布在机体各组织和器官中的亚家族成员。早期人们对Endophilin A2的研究主要集中在其调控网格蛋白所介导的胞吞以及与电压依赖性钙通道(voltage-gated Ca²⁺channels,VGCCs)相互作用调节突触囊泡内吞和调控神经元的兴奋性等过程。后来有研究报道,Endophilin A2可抑制金属蛋白酶的内吞,促进细胞外基质的降解,调控细胞内的信号转导。值得注意的是,最近有报道Endophilin A2可通过影响足细胞的胞吞作用而参与调控肾小球滤过和肾病综合征。这些结果为Endophilin A2在肾脏疾病领域的研究打开了新的篇章。然而,Endophilin A2在肾脏纤维化中的功能还远未被揭示。最近我们在研究Orai1对肾脏纤维化调控作用的过程中意外发现,Endophilin A2在纤维化的肾组织中蛋白表达下调了,在TGF-β1处理的肾小管上皮细胞中蛋白表达同样下调,而这一变化与Orai1蛋白表达呈负相关。这提示我们,Orai1钙通道和Endophilin A2可能是促进和抑制肾脏纤维化的关键机制。为了揭示Orai1通道介导的Ca²⁺内流在肾脏纤维化的发展形成中的作用和机制,以及探讨Endophilin A2能否与Orai1钙通道联合参与调控肾脏纤维化,本课题主要从以下三个方面开展研究工作:1.分别在高脂饮食诱导Apo E-/-小鼠肾脏纤维化和UUO诱导C57BL/6小鼠肾脏纤维化两种在体模型上,检测干预Orai1蛋白表达或抑制Orai1钙通道介导Ca²⁺内流对肾脏纤维化形成及相关纤维化因子表达情况的影响;2.采用体外培养肾小管上皮细胞,从分子水平探讨Orai1钙通道调控肾脏纤维化形成的作用机制;3.分别在离体细胞水平和在体转基因小鼠肾脏纤维化模型上,研究Endophilin A2对肾脏纤维化发挥的作用。第一部分抑制Orai1钙通道可减轻高脂饮食和UUO诱导的小鼠肾脏纤维化的形成为了探讨Orai1钙通道是否参与调控肾脏纤维化的形成,我们在Apo E-/-小鼠高脂饮食诱导或UUO诱导的肾脏纤维化模型上检测了Orai1蛋白在肾脏的表达情况,并进一步通过沉默Orai1的蛋白表达或抑制Orai1钙通道的功能,观察小鼠肾脏纤维化形成情况。结果如下:肾皮质,在肾髓质中表达较少。而在肾皮质中,Orai1在肾小管中的表达高于肾小球。通过与肾小管标记物Na+/H+交换体NHE3免疫荧光共定位进一步证实,Orai1在肾皮质的表达主要集中在肾小管。同时,在离体细胞中也证明Orai1在肾小管上皮细胞中的表达高于肾小球系膜细胞,提示Orai1在肾小管上皮细胞中发挥着更重要的作用。1.通过免疫组化染色,检测出Orai1在Apo E-/-小鼠肾脏切片中主要集中表达在2.8周龄Apo E-/-小鼠,给予高脂饮食12周,观察肾皮质中Orai1的表达情况。结果显示,与正常饮食组相比,高脂饮食组的小鼠肾皮质Orai1蛋白表达和m RNA表达都明显增多。3.8周龄Apo E-/-小鼠,给予高脂饮食8周后,通过尾静脉注射Orai1干扰腺病毒载体（Ad-Orai1-sh RNA,5x109 pfu/只）沉默体内Orai1表达,或注射对照干扰腺病毒载体（Ad-GFP-sh RNA,5x109 pfu/只）作为阴性对照,继续高脂饮食4周后观察小鼠肾脏纤维化形成情况。结果显示:与Ad-GFP-sh RNA处理组相比,Ad-Orai1-sh RNA处理组Apo E-/-小鼠肾皮质中,Orai1的蛋白表达量和m RNA表达量均下降。通过Masson Thrichrome和Sirius Red染色观察Apo E-/-小鼠肾脏胶原蛋白表达情况,结果显示与正常饮食对照组相比,高脂饮食的Apo E-/-小鼠出现明显的肾脏纤维化病变。Ad-Orai1-sh RNA处理组小鼠肾小管间质中胶原着色面积明显低于Ad-GFP-sh RNA处理组。4.8周龄Apo E-/-小鼠,给予高脂饮食8周后,每天一次腹腔注射10 mg/kg的SKF96365或对照试剂PBS,同时高脂饮食。4周后通过Masson Thrichrome和Sirius Red染色观察小鼠肾脏胶原蛋白表达情况。结果显示:SKF96365处理组小鼠肾皮质中胶原表达明显低于PBS处理组。5.通过沉默Apo E-/-小鼠体内Orai1表达或者抑制Orai1钙通道活性,可以保护由高脂饮食诱导的小鼠肾脏功能损伤。结果显示,抑制Orai1钙通道可降低由高脂饮食引起的小鼠血清肌酐水平和尿蛋白含量的上升。6.与肾脏纤维化相关的因子包括有fibronectin、a-SMA、collagen I、III、IV、TGF-β1,smad3等。与正常饮食组相比,高脂饮食的Apo E-/-小鼠肾皮质中,上述纤维化相关因子的蛋白表达量都明显升高。而Ad-Orai1-sh RNA处理组与Ad-GFP-sh RNA处理组相比,上述纤维化相关因子的蛋白表达量则有明显的降低。同样,SFK96365处理组与PBS对照组相比,上述纤维化相关因子的蛋白表达量亦有明显的减少。通过免疫组化的方法分别检测fibronectin、a-SMA、collagen I、III、IV在不同处理组Apo E-/-小鼠肾脏中的蛋白表达情况,结果与Western blot结果一致。7.对12周龄的C57BL/6小鼠进行单侧输尿管闭塞手术（UUO）或假手术（sham）处理,分别在术后第1天和第3天通过尾静脉注射Orai1干扰腺病毒载体（Ad-Orai1-sh RNA,5x109pfu/只）或对照干扰腺病毒载体（Ad-GFP-sh RNA,5x109pfu/只）,或者在术后每天腹腔注射10mg/kg的SKF96365或对照试剂PBS。分别在术后第7天和第14天处死小鼠,收集手术侧肾脏,观察纤维化病变情况。结果显示:Masson Thrichrome染色结果反映,与sham组相比,UUO组小鼠出现明显的肾脏纤维化病变。UUO-Ad-Orai1-sh RNA处理组和UUO-SFK96365处理组小鼠的肾脏纤维化程度都较对照组有明显的下降。8.Western blot和免疫组化分别检测sham和UUO模型组小鼠肾皮质fibronectin、a-SMA、TGF-β1和collagen I、III、IV蛋白表达情况,结果如下:假手术组中,上述纤维化因子蛋白表达在各处理组中均无明显差异。而UUO处理后,14天UUO诱导的上述纤维化因子蛋白表达比7天UUO明显增多;无论是7天UUO还是14天UUO,Ad-Orai1-sh RNA处理组小鼠肾皮质表达上述纤维化因子都较Ad-GFP-sh RNA处理组明显降低;同样,与PBS对照组相比,SKF96365处理组表达上述纤维化因子都明显减少。值得注意的是,Orai1和STIM1蛋白表达在UUO处理后的小鼠肾脏都有明显增加。9.从临床上收集了3例肾脏纤维化患者（分别是慢性肾小管-间质肾炎,Ig A肾病综合征和局灶增生性Ig A肾病综合征）和1例对照病例患者（微小病变肾病）的肾脏活检组织。Masson Trichrome染色表明在局灶增生性硬化和肾小管肾炎的患者肾脏组织有明显的纤维化病变,而微小病变肾病患者肾脏组织的纤维化病变轻微。免疫细胞化学染色显示Orai1高表达于肾小管上皮细胞,同时在肾小球细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等也有表达。免疫组织化学染色显示Orai1在肾脏纤维化患者的肾脏组织中的蛋白表达量都明显高于对照病例患者。表达较低。2.高脂饮食和单侧输尿管结扎均可诱导小鼠肾脏形成纤维化病变。Orai1在纤维化的肾脏中的表达量上调。3.Orai1在肾脏纤维化患者的肾脏组织中蛋白表达量增高。4.沉默Orai1的表达或者抑制Orai1钙通道,可降低由高脂饮食和UUO诱导的小鼠肾脏纤维化程度,改善肾功能。小结1.Orai1在肾脏中主要集中表达于肾皮质中的肾小管,而在肾髓质和肾小球中第二部分Orai1钙通道调控肾脏纤维化的作用机制为了进一步阐明Orai1钙通道参与调控肾脏纤维化的作用机制,本部分我们首先探讨了TGF-β1对肾小管上皮细胞胞内钙离子水平和纤维化相关因子表达的影响,并进一步从TGF-β/smad信号通路、Ca²⁺-Ca MK II和Ca²⁺-calcineurin信号通路研究了Orai1钙通道促进肾脏纤维化形成的分子机制。结果发现:1.人肾小管上皮细胞（HK2）转染Orai1干扰腺病毒载体（Ad-Orai1-sh RNA,200 MOI）后,Orai1蛋白表达明显降低。TGF-β1（5 ng/ml）处理HK2细胞可触发钙离子内流,而当沉默Orai1或STIM1蛋白表达后,由TGF-β1诱导的胞外Ca²⁺内流则明显受到抑制。Ang II（100 nmol/l）同样可促进HK2细胞Ca²⁺内流升高,抑制Orai1钙通道可降低由此引起的胞内钙离子水平的上升。2.TGF-β1（5 ng/ml）和Ang II（100 nmol/l）作用于HK2细胞48小时均可以诱导fibronectin和collagen IV的蛋白表达上调。当细胞转染Ad-Orai1-sh RNA抑制Orai1表达时,可降低TGF-β1和Ang II诱导的fibronectin和collagen IV蛋白表达增加。3.TGF-β1（5 ng/ml）作用于HK2细胞30 min可以明显诱导smad2/3的磷酸化水平升高,而沉默Orai1蛋白表达则明显抑制TGF-β1诱导的smad2/3磷酸化水平增加,而对smad2/3总蛋白表达无影响。同样,HK2细胞预孵育SOCC阻断剂SKF96365（20μmol/l）或钙释放抑制剂2-APB（100μmol/l）均可抑制TGF-β1诱导的smad2/3磷酸化水平升高,smad2/3总蛋白表达无明显变化。提示Orai1钙通道在HK2细胞中参与了TGF-β/smad信号通道。4.HK2细胞预孵育calcineurin抑制剂FK-506（10μmol/l）可以明显抑制TGF-β1诱导的smad2/3磷酸化水平升高和fibronectin、collagen IV蛋白表达增加,而预孵育Ca MK II抑制剂KN-93（10μmol/l）对smad2/3磷酸化水平和fibronectin、collagen IV蛋白表达均无明显影响。预孵育FK-506或KN-93均不影响HK2细胞smad2/3总蛋白表达。这说明Ca²⁺-calcineurin而不是Ca²⁺-Ca MK II信号介导了TGF-β1诱导的肾脏纤维化过程。5.TGF-β1（5 ng/ml）作用于细胞48小时可以诱导HK2细胞发生形态改变,包括细胞变成长梭形、过度增大,并失去细胞粘着性。同时,上皮细胞的标记物E-cadherin表达减低,而间质细胞的标记物a-SMA、vimentin和S100A4的表达增高。转染Ad-Orai1-sh RNA或预孵育SKF96365和2-APB抑制Orai1钙通道均可以逆转TGF-β1诱导的细胞形态改变,抑制E-cadherin表达下调以及a-SMA、vimentin和S100A4的表达上调。结果表明Orai1钙通道参与了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的转分化过程。小结1.TGF-β1和Ang II均能引起HK2细胞胞内钙离子水平的增加,并能诱导细胞表达纤维化因子增加,其中TGF-β1的诱导作用比Ang II明显。2.沉默Orai1表达可显著抑制TGF-β1和Ang II诱导的HK2细胞Ca²⁺内流升高和纤维化因子表达增加。3.Orai1钙通道介导的Ca²⁺内流通过Ca²⁺-calcineurin通路参与了TGF-β/smad信号的调控。4.阻断Orai1钙通道能抑制TGF-β1诱导的HK2细胞转分化,从而参与保护肾脏纤维化的发生发展。第三部分Endophilin A2作为Orai1下游信号分子抑制肾脏纤维化形成结合前面的研究结果,为了进一步阐明Orai1钙通道参与保护肾脏纤维化的的调控机制,本部分我们在发现Orai1钙通道激活抑制Endophilin A2表达的基础上,进一步观察了Endophilin A2对HK2细胞生成细胞外基质的影响,并采用Endophilin A2转基因小鼠观察其对肾脏纤维化的影响。1.Endophilin A2在小鼠肾脏主要表达于肾小管上皮细胞,在髓质和肾小球中表达都较低。这一特性与Orai1蛋白的表达分布相一致。2.从前面UUO诱导的肾脏纤维化的小鼠中发现,Endophilin A2蛋白在纤维化的肾组织中表达减少;Ad-Orai1-sh RNA组小鼠肾皮质的Endophilin A2蛋白表达与Ad-GFP-sh RNA组相比明显增高。在HK2细胞中,TGF-β1处理后,Endophilin A2蛋白表达呈时间依赖性降低,而Orai1则呈时间依赖性增加。提示Endophilin A2参与了肾脏纤维化形成过程和肾小管上皮细胞的性状转变过程,并和Orai1有关联。3.前面我们发现,Orai1钙通道可以通过影响TGF-β/smad信号通道参与HK2细胞EMT过程。为了进一步探讨Endophilin A2在肾脏纤维化中的作用,我们随后研究了Endophilin A2在HK2细胞中对TGF-β/smad信号通道和细胞生成基质的作用。结果显示:过表达Endophilin A2可抑制TGF-β1诱导的smad3磷酸化和FN、collagen IV蛋白表达增高,而对smad3总蛋白表达无影响;沉默Endophilin A2可进一步增加TGF-β1诱导的smad3磷酸化和FN、collagen IV蛋白表达增高,smad3总蛋白表达亦无明显变化。表明Endophilin A2参与保护肾小管上皮细胞EMT。4.Endophilin A2转基因小鼠的鉴定:PCR结果显示有270 bp大小产物的即为转基因型小鼠;同时,Western blot结果显示,转基因小鼠肾脏Endophilin A2蛋白表达明显增多。5.正常状态下,Endophilin A2转基因小鼠肾脏形态与WT野生型小鼠无明显差异,但FN、a-SMA、TGF-β1和collagen I、III、IV蛋白在Endophilin A2转基因小鼠肾脏表达比WT小鼠的低。而当用UUO诱导小鼠形成肾脏纤维化时,Endophilin A2转基因小鼠肾脏纤维化病变程度明显轻于WT小鼠;同时,Endophilin A2转基因可抑制由UUO诱导的小鼠肾皮质表达FN、a-SMA、TGF-β1和collagen I、III、IV蛋白的增高。小结1.Endophilin A2在纤维化病变的肾脏和肾小管上皮细胞中表达逐渐减少,并与Orai1的表达呈负相关。2.抑制Orai1钙通道的活性可升高Endophilin A2的表达水平。发挥保护作用。3.Endophilin A2可抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT,并对肾脏纤维化结论1.Orai1在肾脏中主要表达在肾小管的上皮细胞,肾脏纤维化病变组织Orai1蛋白表达增加。2.抑制Orai1钙通道可减轻肾脏纤维化的病变程度,改善高脂血症诱导的肾功能损害。3.Orai1钙通道主要通过调控TGF-β/smad信号通路,促进肾小管上皮细胞的转分化,进而参与肾脏纤维化的调控。4.Endophilin A2表达受Orai1钙通道调控,高表达Endophilin A2抑制TGF-β/smad信号通路,减轻肾脏纤维化。