骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP),是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族成员之一,属于Dpp/Vg1亚家族。近年来,随着研究的深入,对BMP的了解日益增多。BMP参与骨骼系统、神经系统、血液系统、内分泌系统、泌尿系统等多系统的生理功能及病理过程。其中,BMP-7(又名OP-1)是一种具有强大骨诱导活性的成骨因子,具有较强的异位诱导成骨作用;在骨发育中可诱导软骨的形成。体外研究表明,rhBMP-7可刺激间充质细胞增值,并诱导间充质细胞向成软骨细胞、成骨细胞的分化。BMP-7作为一种骨诱导因子,在胚胎的骨骼发育和骨修复中发挥重要作用;BMP-7在肾脏发育中具有诱导组织相互作用的潜在功能,是重要的肾脏形态发生蛋白和肾脏内分泌激素。BMP-7具有广阔的临床应用前景,美国FDA已经批准其用于骨折及长骨骨不连的治疗方面。　　 目前,临床使用的rhBMP-7均为真核细胞表达,真核细胞表达rhBMP-7表达量低,成本高,价格昂贵,限制了其在临床上的应用。而采用原核表达系统表达rhBMP-7具有操作简单,基因稳定,表达量高的特点,缺点是原核表达系统不能进行翻译后正确折叠和修饰,不能直接获得具有活性的rhBMP-7,需要经过变性、复性等工艺进行处理。本实验室前期已对原核表达系统表达rhBMP-7进行了一定研究,能获得较高表达量的rhBMP-7,并对其纯化、复性工艺及骨诱导活性和安全性进行了进一步研究。但是,在质量控制方面尚存在一定问题,特别是体外活性测定的方法影响因素多、不稳定。作为一种新药必须具备三个基本条件,即:有效、安全和质量可控。质量可控,特别是生物活性的检测和控制是rhBMP-7成为一种新药的重要条件。本研究根据前期实验室存在的问题和实验数据,试图通过体内实验方法,建立起新的活性测定方法。另外,BMP-7抗体对rhBMP-7质量标准的制定和rhBMP-7生产过程的质量控制有重要作用,同时,BMP-7抗体对于研究BMP-7在机体的分布、定位及功能分析具有重要意义,鉴于BMP-7抗体国内研究较少且价格昂贵,而本实验室制备的rhBMP-7已经进行了氨基酸序列的分析确证,与人成熟肽序列一致,因此本研究采用rhBMP-7皮内多点注射法免疫新西兰大白兔制备BMP-7抗体,并对其进行鉴定。　　 内容与目的：　　 (1)通过rhBMP-7复合载体材料小鼠体内埋植方法,检测载体材料内细胞数量、蛋白质及钙离子含量差别,探索建立一种检测BMP-7活性的方法,为其质量控制和质量标准制定建立稳定可行的检测方法。(2)利用制备的rhBMP-7免疫动物制备抗体,并对制得的抗血清测定效价、特异性、最佳稀释度、灵敏度,为其推广应用提供理论依据。　　 方法：　　 (1)BMP-7活性测定方法的建立:经重组大肠杆菌发酵获得高表达量的rhBMP-7,菌体经超声裂解获得包涵体,包涵体用8mol/L尿素溶解,经离子交换层析法对目的蛋白进行纯化,通过透析方法进行复性,获得rhBMP-7二聚体。将吸收性明胶海绵及PLA加工成直径为5mm、厚度为2mm的圆片状,与透析复性的rhBMP-7混匀后反复抽气放气,使不同剂量rhBMP-7充分吸附在明胶海绵及PLA载体上,置于冷冻干燥机中冻干,制备的rhBMP-7/明胶海绵、rhBMP-7/PLA植入剂环氧乙烷灭菌后,植入小鼠后腿股部肌间隙。分别设立载体对照组和50μg rhBMP-7/明胶海绵组、100μg rhBMP-7/明胶海绵组、150μgrhBMP-7/明胶海绵组、250μg rhBMP-7/明胶海绵实验组及50μg rhBMP-7/PLA组、250μg rhBMP-7/PLA实验组,明胶海绵材料于第2、3周取材进行细胞计数、蛋白含量测定和组织切片观察,PLA材料第3、4、5周取材进行钙含量测定和组织切片观察,将测定结果用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。　　 (2)BMP-7抗体的制备:利用rhBMP-7(纯度＞97％)制备BMP-7抗体,Bradford法测定蛋白浓度为1.5mg/ml,与佐剂混合后,采用皮内多点注射法免疫新西兰大白兔4次,每次间隔2周。免疫后颈动脉插管取血。ELISA法测定抗血清效价,Western blot确定抗血清特异性、最佳稀释度、灵敏度。　　 结果：　　 (1)纯化后,rhBMP-7单体纯度高达97％以上,纯化后的rhBMP-7经透析方法复性,可获得rhBMP-7二聚体。明胶海绵载体材料在术后第2周,第3周取材进行HE染色、显微镜观察,与单纯植入明胶海绵相比,rhBMP-7/明胶海绵组细胞数量明显增多,并且细胞数量随着rhBMP-7剂量的增加及时间的延长而增多;蛋白含量测定结果显示,在同一时间点,与对照组相比,rhBMP-7/明胶海绵组蛋白含量增加,并且随着rhBMP-7剂量的增加,蛋白含量出现一定的剂量依赖性;与第2周蛋白含量测定结果相比,第3周相同剂量组蛋白含量均比前一周有所增加。通过对两周蛋白含量数据进行线性回归分析发现,第2周rhBMP-7剂量与蛋白含量的相关系数R2=0.566,而第3周rhBMP-7剂量与蛋白含量的相关系数R2=0.472。在不同时间点取材时,单纯植入PLA材料组细胞数量及钙含量基本不变,rhBMP-7/PLA组钙含量增加,并呈现一定的剂量依赖性。　　 (2)采用颈动脉插管方式每只采血50-70ml,通过ELISA法测定抗血清效价为1∶640000;通过从小鼠心脏组织、肝脏组织、骨组织及肾脏组织中提取的蛋白鉴定了制备的BMP-7抗体,抗血清的最佳稀释度为1∶5000～1∶50000,灵敏度可达1ng。　　 结论：　　 通过rhBMP-7复合明胶海绵及PLA小鼠体内埋植方法,比较载体材料内细胞数量、蛋白质及钙离子含量差别,发现将rhBMP-7复合明胶海绵植入小鼠后腿肌间隙第2周取材进行蛋白含量测定的方法可用于rhBMP-7活性测定,此方法优点在于实验操作简单,实验持续时间较短。成功制备了BMP-7抗体,经实验证实,该抗体具有很高的效价和灵敏度,对鉴定rhBMP-7、深入研究BMP-7蛋白在发育中的生物学效应,寻找BMP-7相互作用蛋白及进一步阐明BMP-7对重要细胞过程的影响有重要意义。