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单宁酸（Tannic acid）是一类水溶性多酚,广泛存在于石榴、五倍子、葡萄和芒果等植物中。由于单宁酸具有很强的抗氧化、抗炎、降糖降脂和抗癌活性而倍受关注。然而,目前单宁酸抑制肿瘤的分子机制以及发挥抗肿瘤作用的靶点尚不清楚。本研究利用单宁酸功能化磁性纳米颗粒来鉴定单宁酸在结肠癌细胞中的靶蛋白,同时深入研究单宁酸如何通过该靶蛋白发挥抑制结肠癌细胞增殖的功效,并探讨单宁酸与靶蛋白发生相互作用的位点和作用方式。我们从以下三个方面开展研究工作:1.利用Fe3O4磁性纳米颗粒的特异性吸附功能,以磁性纳米颗粒作为载体,在乙醇中把单宁酸修饰在Fe3O4磁性纳米颗粒上,然后利用透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱仪进行分析确认。然后利用solid-phase实验,采用pull down垂钓出单宁酸在结肠癌细胞中的特异性结合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和银染法确定差异蛋白,质谱检测发现单宁酸与M2型丙酮酸激酶（Pyruvate kinase M2,PKM2）特异性结合。2.通过MTT法和细胞克隆形成实验,发现单宁酸显著抑制结肠癌细胞DLD1和HCT-116的细胞增殖,而对人正常上皮细胞FHC的细胞增殖无影响。实验探讨了PKM2的哪种激酶活性在单宁酸抑制结肠癌细胞增殖中发挥关键作用。结果发现重组GST-PKM2蛋白可促使Akt蛋白磷酸化水平升高,加入单宁酸并不能使得由重组GST-PKM2引起的Akt磷酸化水平降低。这表明单宁酸抑制的结肠癌细胞增殖并不依赖于PKM2的蛋白激酶活性。进一步过表达PKM1来研究丙酮酸激酶活性在单宁酸抑制结肠癌细胞增殖中的作用。结果发现,与瞬时转染GFP的对照组相比,瞬时转染GFP-PKM1能够逆转单宁酸对结肠癌细胞活性的抑制作用。这表明单宁酸抑制结肠癌细胞增殖依赖于PKM2的丙酮酸激酶活性。酶活力实验结果显示,单宁酸能够明显抑制PKM2的丙酮酸激酶活性,而对PKM1的酶活性抑制效果不明显。综上所述,单宁酸特异抑制PKM2的丙酮酸激酶活性。3.荧光光谱结果显示,单宁酸与PKM2之间存在相互作用。酶动力学结果显示,单宁酸与PKM2的抑制类型属于非竞争性抑制。Pull down结果显示,Fe3O4磁性纳米颗粒能够与His-PKM2蛋白发生相互作用,而与His-PKM1无相互作用。化学交联反应结果显示,单宁酸处理使得PKM2的四聚体含量减少。由于果糖1,6-二磷酸（Fructose 1,6-bisphosphate,FBP）能别构调节PKM2,促使PKM2四聚体的形成,因此我们研究了单宁酸抑制PKM2的活性是否与别构调节相关。结果显示,单宁酸抑制PKM2的活性并不能被FBP所逆转。这表明单宁酸可能占据了FBP与PKM2的结合位点。由于FBP别构调节PKM2的结合位点上有六个重要的氨基酸位点,而且已知影响PKM2丙酮酸激酶活性的只有第399位精氨酸（R399）和第433位亮氨酸（K433）。我们采用pull down实验,发现单宁酸能够结合His-R399E蛋白,而与His-K433E蛋白没有相互作用。采用MTT和酶学实验探讨单宁酸抑制PKM2丙酮酸激酶活性和结肠癌细胞增殖是否依赖其与PKM2的K433位点结合。结果发现,单宁酸能够明显抑制DLD1-GFP细胞的增殖以及PKM2酶活性,而单宁酸对DLD1-K433E的细胞增殖以及PKM2酶活性的抑制效果不明显。这些结果说明,单宁酸通过结合于PKM2的K433位点,导致PKM2代谢活性降低进而抑制结肠癌细胞增殖。以上结果表明,单宁酸通过与PKM2上K433结合,特异性抑制PKM2的丙酮酸激酶活性,来实现对结肠癌细胞增殖的抑制。