共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是一组天然存在的具有18个碳原子,含有共轭双键的多不饱和脂肪酸,是亚油酸(linoleic acid, LA)的位置和几何异构体。许多研究发现：CLA具有防止动脉粥样硬化、抗糖尿病、提高机体免疫力、增加骨密度、减少体脂等多种生理功能,其中CLA抗肿瘤的作用日益受到研究者的广泛关注。CLA是目前已知的抑癌能力最强的脂肪酸,对肿瘤发展的早期阶段、肿瘤细胞增生阶段和转移阶段均有影响。现已证实它在动物体内能减少肿瘤体积并对肿瘤细胞具有抑制其生长增殖分化的作用,包括乳腺癌、皮肤癌、前胃癌、胸腺癌和结肠癌等。此外,CLA对乳腺癌细胞(SKBr3、SKBR3、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB468)、肺癌细胞(A-427、SK-LU-1、A-549)、肝癌细胞(HepG2)、人胃腺癌细胞(SGC-7901)、结肠癌细胞(SW480)、直肠癌细胞(HT-29)、前列腺癌细胞(PC-3、DU145)、恶性胶质瘤细胞(M21-HPB)、神经胶质瘤细胞(A172)等肿瘤细胞具有强大的抑制作用。CLA通常以多种异构体的混合物的形式存在。天然存在的CLA其异构体主要以c9, tll-CLA为主,该异构体含量达80%以上。人工合成的CLA则以c9,t11-CLA和t10, c12-CLA两种混合物为主,约各占40%以上,其他CLA异构体(包括t7, t9; c9, c11; t9, t11; c10, c12; t10, t12; t11, t13和c11, c13-CLA)占剩余的10-15%。研究发现：c9, t11-CLA不仅是天然CLA的主要异构体,也被认为是最主要的活性形式。因此,如何提高c9, t11-CLA的含量成为人们关心的话题。肿瘤化疗是肿瘤临床治疗的一个重要手段。然而肿瘤多药耐药(MDR)是癌症化疗失败的重要因素。肿瘤细胞的MDR是由一种药物诱发,引起对其它多种不同结构的药物同时产生交叉耐药的现象,导致一些化疗方案的失败。多药耐药产生的机制比较复杂,其中P-糖蛋白(P-gp)的过度表达是最重要的原因。现已发现P-gp在肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞癌、人急性粒细胞白血病、大肠癌等很多肿瘤细胞膜上大量表达,其疏水区具有结合和转运药物的功能,其结合位点与ATP结合并水解供能,从而引起构象改变将胞浆内的化疗物泵到细胞间隙,使细胞内蓄积的抗肿瘤药物减少,从而引起肿瘤耐药。寻找MDR逆转剂与抗癌药物合用,恢复MDR细胞对抗癌药物的敏感性,是克服临床肿瘤耐药的一种方法,具有较好临床应用前景。研究表明：我国传统中药冰片具有极强的体内外逆转P-gp活性,且毒性较低,能有效阻止肿瘤细胞内的药物外排作用,提高抗肿瘤药物的细胞内浓度,从而增加肿瘤细胞对药物的敏感性,减少肿瘤耐药的发生。研究目的1本研究将抗肿瘤药物CLA与有P-gp活性抑制效果的祖国传统中药单体—冰片进行酯化反应合成为酯,得到一个新的化合物共轭亚油酸冰片酯(conjugated linoleic acid borneol ester,BCLA),以期CLA的抗肿瘤活性和冰片的肿瘤MDR逆转效果结合起来,增强CLA在肿瘤细胞中的浓度,从而增加肿瘤细胞对CLA的敏感性,起到联合增效作用。2天然来源的CLA含量少,价格较高,目前大部分CLA由化学异构法得到,但其异构体组成复杂,生理活性差。c9,t11-CLA被认为是最主要的活性形式,利用冰片通过酶催化法来分离纯化c9,t11-CLA异构体以增强CLA的纯度和生理活性有其现实和经济价值。3考察合成的产物BCLA对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用。研究方法和结果本研究课题通过在无溶剂体系中使用生物酶催化的方法将冰片引入到CLA的羧基位得到BCLA,用碱滴定法和分子蒸馏法分离纯化了酯化产物,合成品结构经GC-MS、1H-NMR、13C-NMR分析鉴定确认。试验利用单因素试验设计考察了反应时间和生物催化酶的种类,采用响应面曲线法(RSM)优化了酶反应的参数,如温度、酶用量、水用量,反应时问等,优化后的酶催化反应条件为：在无溶剂体系下,以脂肪酶AYS为催化剂,用量为冰片重量的40%,反应时间48h,温度40℃,pH7.0缓冲溶液用量为30%和底物摩尔比为2.5,反应转化率可达到79.2±0.5%。采用酶催化分离纯化了CLA的活性异构体,GC-MS分析主要产物为：异龙脑-c9,t11-CLA 35.8%,异龙脑-T10,c12-CLA 6.3%,龙脑-c9,t11-CLA 43.4％,龙脑-t10,c12-CLA 14.5％,c9,t11-CLA的含量(79.2%)几乎是t10, c12-CLA含量(20.8%)的四倍。试验进一步对BCLA的抗肿瘤活性进行了初步研究。体外培养人肝癌HepG2细胞、人肝癌Huh7细胞和人结肠癌Lovo细胞,采用不同浓度(6.5、12.5、25、50、100、200μM)BCLA.CLA和冰片连续作用于上述细胞24h后,通过在光学显微镜下观察细胞形态学变化；利用MTT法检测BCLA.CLA和冰片对各种肿瘤细胞的增殖抑制作用,发现在这三种细胞模型条件下BCLA和CLA表现出细胞增殖抑制作用,且与细胞类型、药物的浓度有关。BCLA对HepG2细胞的肿瘤细胞毒性作用强于CLA;BCLA对Lovo细胞的细胞毒性作用弱于CLA；与CLA比较,BCLA对Huh7细胞的肿瘤细胞毒性作用强弱有赖于两者浓度,在低剂量时BCLA对Huh7细胞的细胞毒性作用强于CLA,在高剂量时BCLA对Huh7细胞的细胞毒性作用弱于CLA。冰片虽然在实验浓度下没有显著的直接抑制肿瘤细胞生长的效果,但也可以初步看出具有剂量依赖性,随着药物浓度的增加对肿瘤细胞生长的抑制率也在逐渐增大。MTT结果显示：在200μM浓度下,BCLA.CLA和冰片对人肝癌HepG2细胞抑制作用的IC50值分别为114.84±11.11μM,156.2±5.85μM,468.87±16.09gM；对人肝癌Huh7细胞抑制作用的IC50值分别为153.89±3.19μM,99.33±1.82μM,271.88±22.99μM;对人结肠癌Lovo细胞抑制作用的IC50值分别为148.23±6.58μM,54.97±1.37μM,537.41±6.81μM。BCLA对HepG2、Huh7和Lovo细胞均有抑制作用。结论本试验成功合成了BCLA,合成的BCLA中c9, t11-CLA的纯度达到了79.2%, c9,t11-CLA和t10, c12-CLA的含量比与天然存在的CLA中这2种异构体的含量比非常接近,较好地模拟了天然来源的CLA的药理性质和特点。抗肿瘤初步试验表明CLA和冰片发挥了各自的功能,对不同肿瘤细胞系作用强度有差异。与CLA和冰片相比,BCLA达到了抗肿瘤协同增效的效果。