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研究背景原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤,死亡率高,在恶性肿瘤导致死亡的原因中居第三位。相当多的肝癌发现时已是晚期,即使是接受根治手术的病人术后5年仍有30%至40%的复发率。晚期肝癌病人的中位生存时间为6到8个月,对于晚期肝癌的病人还没有有效的治疗方法。因而寻找肝癌治疗的新靶点具有重要的临床意义。研究发现我国临床上常用的抗肿瘤中成药蟾酥制剂的有效成分强心苷类物质蟾毒灵(bufalin)具有抑制肿瘤细胞株增殖、诱导凋亡、逆转耐药细胞株耐药的作用,并发现bufalin可以抑制肿瘤细胞株Akt的磷酸化。Akt磷酸化后引起调节蛋白表达的改变在肿瘤的生长、增殖、凋亡、运动、上皮间质转化、血管生成和转移中发挥重要作用。而bufalin对人肝癌细胞株侵袭迁移的作用尚未见报道,预实验研究表明bufalin可以抑制HCCLM3细胞株体外迁移,但其作用机理还不明了,其抑制肿瘤细胞迁移是否与抑制Akt磷酸化继而影响下游调节蛋白的表达还有待研究,本实验将从体外实验探讨bufalin对人肝癌细胞株增殖、迁移、侵袭、黏附的影响及其与Akt信号通路关系,以期为蟾酥制剂的抗肿瘤作用尤其是抑制肿瘤侵袭方面提供实验依据。研究目的本研究从体外实验观察bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3. HepG2增殖、迁移、侵袭、黏附生物学行为的影响,并以Akt为靶点,研究bufalin对Akt信号通路相关蛋白Akt、pAkt(Ser473)、pGSK-3β (Ser-9)、 GSK-3β、β-catenin(Ser33/37)、β-catenin、E-cadherin的表达及β-catenin核易位的影响,探讨bufalin对Akt—GSK-3β—β-catenin—E-cadherin信号通路的影响及其抑制肿瘤增殖、迁移、侵袭、黏附作用的机理。研究方法体外实验评价bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2增殖、迁移、侵袭、黏附作用的影响。通过CCK8法评价bufalin对人肝癌细胞株的增殖抑制作用；划痕实验及Transwell-migration模型评价bufalin对人肝癌细胞株迁移能力影响；Transwell-invasion模型评价bufalin对人肝癌细胞株侵袭能力的影响；黏附实验观察bufalin对人肝癌细胞株黏附能力的影响。Western bolt检测Akt、 pAkt(Ser473)、pGSK-3β(Ser-9)、GSK-3β、β-catenin(Ser33/37)、β-catenin、 E-cadherin的表达,细胞免疫荧光检测β-catenin核易位情况及E-caherein的表达。结果1、Bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株增殖的影响HCCLM3经0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L10000nmol/L、100000nmol/L bufaliln处理48h后的增殖抑制率分别为0.071±0.076、0.241±0.024、0.485±0.009、0.777±0.005、0.834±0.175、0.871±0.007。 HepG2相应的抑制率分别为：0.208±0.029、0.350±0.050、0.486±0.019、0.793±0.011、0.835±0.013、0.886±0.016。GraphPad Prism5.0计算HCCLM3的IC50(48h)为66.90nmol/L, HepG2的IC50(48h)为97.43nmol/L。2、Bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株迁移的影响划痕实验发现,HCCLM3经0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/Lbufaliln处理24h后,迁移率分别为0.453±0.028、0.251±0.036、0.175±0.022、0.117+0.027,相应药物处理48h后迁移率分别为0.650+0.048、0.468+0.052、0.419+0.014、0.236±0.046,各组与对照组均有明显差异(P<0.01)。HepG2相应药物浓度处理24h迁移率分别为0.684±0.026、0.653±0.035、0.604±0.022、0.325±0.010,10nmol/L以上药物浓度与对照组相比有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01),48h迁移率分别为0.840±0.050、0.761±0.026、0.661±0.029、0.416±0.014,10nmol/L以上药物浓度与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。Transwell-migration模型发现HCCLM3经0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L bufaliln后,48小时穿膜个数(200倍视野下,5个视野)分别为105±12、92.7±12.2、41±5.6、29.7±4.2,其中10nmol/L以上药物浓度处理过后,穿过细胞个数与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。在HepG2细胞株中48小时穿膜个数(200倍下,5个视野)分别为408+20.7、307±15.7、220±16、205.3+10,实验组与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。3、Bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株侵袭的影响Transwell-invasion模型发现HCCLM3经Onmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L bufaliln处理48h后,48小时穿膜个数(200倍视野下,5个视野)分别为69.7±8.5、35.3±4.7、23.7±4.2、14.7±2.5,实验组与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。在HepG2细胞株中48小时穿膜个数(200倍视野下,5个视野)分别为91±11.5、65.3±8.5、47±6.3、37±2.6,实验组与对照组相比有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01)。4、Bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株黏附的影响0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L bufaliln处理后,HCCLM3细胞黏附的个数(200倍视野下,每个视野)分别为497±20、398±16、125±14、102±5553±13、454±14、241±7、110±6, HepG2细胞黏附的个数(200倍视野下,每个视野)为514±17、417±22、217±7、145±13。在两组细胞株中,10nmol/L以上药物浓度明显抑制细胞的黏附(P<0.01)。5、Western bolt检测Akt、pAkt(Ser473)、pGSK-3β (Ser-9)、GSK-3β、β-catenin(Ser33/37)、β-catenin、E-cadherin的表达Western bolt分析bufalin及LY294002处理过的HCCLM3、HepG2细胞株pAkt(Ser473)、pGSK-3β (Ser-9)减少,Akt表达无明显变化,GSK-3β表达增加,β-catenin的表达无明显变化,E-cadherin的表达增加。6、细胞免疫荧光检测β-catenin的核易位及E-cadherin的表达细胞免疫荧光发现,bufalin及LY294002可以抑制HCCLM3及HepG2细胞株β-catenin的核易位,在HepG2细胞株更加明显。Bufalin及LY294002可以增加E-cadherin的表达。结论1、Bufalin可以抑制人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株的增殖、迁移、侵袭、黏附能力。2、Bufalin可能通过Akt—GSK-3β—β-catenin信号通路抑制细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附能力。3、其中药物抑制肿瘤细胞增殖作用可能与抑制Akt、GSK-3β的磷酸化及p-catenin的核易位有关；抑制细胞的迁移侵袭能力可能与抑制β-catenin的核易位,逆转人肝癌细胞株间质样表型,增加E-caherin的表达进而降低肿瘤的侵袭运动能力有关；药物处理后细胞黏附能力的降低可能与抑制β-catenin的核转录,细胞与基质的黏附能力下降有关。